摘 要

脊髓受伤是经常出现的一种骨科创伤，常导致残疾或神经功能障碍，被认为是无法治愈的疾病。近年来，随着研究的逐渐深入，针对脊髓损伤修复逐渐成为可能。脊髓损伤难以修复的原因主要有两个，分别是成熟神经细胞再生能力不足以及再生微环境的恶劣，所采用的方法分别是干细胞移植以及构建有效的生物支架。本实验选用壳聚糖、多巴胺以及柠檬酸为原料，构建一种新型的水凝胶修复材料，并对水凝胶的性能进行了测试。

主要研究工作以及研究成果如下所示：

1、以柠檬酸作为交联剂，壳聚糖为基体制备壳聚糖基水凝胶。以柠檬酸的含量为变量设置五组实验，通过对其力学性能的测试以及对细胞毒性的考量，选取壳聚糖与柠檬酸质量比为1/0.15进行下一步实验；

2、向壳聚糖与柠檬酸质量比为1/0.15的水凝胶反应中加入多巴胺，得到新型水凝胶。以多巴胺的含量为变量，设置四组实验，通过对材料性能的表征，探究多巴胺含量对水凝胶性能的影响。

论文第一章详细介绍了用于制备水凝胶的原料的特性和选择原因。第2章描述了不含多巴胺的水凝胶的制备和性能表征。第3章探索多巴胺对水凝胶性能的影响；第四章对整个实验进行了总结。

Abstract

Spinal cord injury is an often-occurring orthopedic trauma that often leads to disability or neurological dysfunction and is considered an incurable disease. In recent years, with the gradual deepening of research, the repair of spinal cord injury has gradually become possible. There are two main causes of spinal cord injury that are difficult to repair. They are the lack of regenerative capacity of mature nerve cells and the poor regenerative microenvironment. The methods used are stem cell transplantation and the construction of an effective biological stent. In this experiment, chitosan, dopamine and citric acid were used as raw materials to construct a new type of hydrogel repair material, and the performance of the hydrogel was tested.

    The main research work and research results are as follows:

    1. Using citric acid as a cross-linking agent and chitosan as a substrate, a chitosan-based hydrogel was prepared. Five groups of experiments were set up with the content of citric acid as a variable. Through the testing of its mechanical properties and the consideration of cytotoxicity, a hydrogel prepared with a mass ratio of chitosan to citric acid of 1/0.15 was selected for further experiments.

    2. Dopamine was added to the hydrogel reaction with a mass ratio of chitosan to citric acid of 1/0.15 to obtain a novel hydrogel. Four groups of experiments were set up with the dopamine content as a variable. Through the characterization of the material properties, the effect of dopamine content on the hydrogel performance was explored.

    The first chapter of the thesis gives a detailed introduction to the characteristics of the raw materials used to prepare hydrogels and the reasons for selection. Chapter 2 describes the preparation and performance characterization of hydrogels containing no dopamine. Chapter 3 describes the hydration of dopamine. The preparation of glue was also used to explore the effect of dopamine on the properties of hydrogels. The fourth chapter summarizes the whole experiment.

关键词：脊髓损伤修复； 水凝胶；仿贻贝；壳聚糖；多巴胺

Key words: spinal cord injury repair; hydrogel; imitation mussel; chitosan; dopamine

目录

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2脊髓修复材料的种类 1

1.3壳聚糖的结构与性质 2

1.3.1壳聚糖的来源 2

1.3.2壳聚糖的结构 2

1.3.3壳聚糖的性质 2

1.4壳聚糖水凝胶的应用 3

1.5贻贝的概述 3

1.5.1贻贝的超强粘附性 3

1.5.2贻贝仿生 4

1.6多巴胺的结构与性能 4

1.7多巴胺的应用 5

1.8柠檬酸概述 5

1.9本课题研究的意义以及内容 5

1.9.1研究意义 5

1.9.2研究内容 6

第二章 壳聚糖基水凝胶的制备与性能研究 7

2.1前言 7

2.2实验原料和仪器 7

2.2.1实验原料 7

2.2.2实验仪器 8

2.3 CS/CA水凝胶的制备 9

2.3.1 MES缓冲溶液的制备 9

2.3.2 CS/CA水凝胶试样制备 9

2.4性能测试及表征 10

2.4.1 CS/CA水凝胶红外光谱表征 10

2.4.2 CS/CA水凝胶孔隙率的测定 10

2.4.3 CS/CA水凝胶溶胀度的测定 10

2.4.4 CS/CA水凝胶力学性能测试 11

2.5结果与讨论 11

2.5.1红外光谱结果分析 11

2.5.2溶胀度 12

2.5.3孔隙率 13

2.5.4 力学性能 14

2.6小结 15

第三章 仿贻贝壳聚糖基水凝胶的制备 16

3.1前言 16

3.2 CS/CA/DA水凝胶的制备 16

3.2.1 MES缓冲溶液的制备 16

3.2.2 CS/CA/DA水凝胶的制备 16

3.3测试方法 17

3.3.1 CA/CS/DA水凝胶红外光谱表征 17

3.3.2 CA/CS/DA水凝胶紫外光谱表征 17

3.3.3 CA/CS/DA水凝胶热重分析 17

3.3.4 CA/CS/DA水凝胶孔隙率测试 17

3.3.6 CA/CS/DA水凝胶力学性能表征 17

3.3.7 扫描电子显微镜（SEM）表征 17

3.4 分析与讨论 18

3.4.1红外光谱 18

3.4.2紫外光谱 19

3.4.3热重分析 19

3.4.4孔隙率 20

3.4.5溶胀度 21

3.4.6力学性能 22

3.4.7场发射扫描 23

3.5本章小结 24

结论 25

第一章 绪论

1.1引言

脊髓在中枢神经与外周神经的连接中起着重要通道的作用，同时它也是把大脑的命令传递到人身体各个部分的关键环节。通常情况下当脊柱遭受到了严重的外力打击，引起脊椎骨骨折，就会造成脊髓受损。毋庸置疑，脊髓损伤会严重影响到患者的生存质量。据调查，美国目前每年新增患者约有1.6万人，患者的平均年龄仅为40.7岁^[1]，大部分为青壮年。尽管随着医疗技术的进步，脊髓损伤患者的存活率以及长期生存率都得到大幅度的提升，但是脊髓损伤导致的患者中枢感觉运动功能的永久性损伤却并未得到很好的医治，目前在世界范围内对此均无有效的治疗方法。因此，脊髓损伤患者的治疗与康复成为当前国际医学科学发展的重大挑战。

当前有研究表明，脊髓损伤的发生是一种多因素，多步骤的级联瀑布效应机制，当脊髓的连续性与完整性遭到破坏后，脊髓灰质和白质血管出血、细胞间质水肿、血管活性胺类物质释放等因素会促进血栓的形成和微血管发生痉挛，阻碍神经细胞的再生。其次，机体会自发地启动继发性的病例损伤程序，但这会导致患处自由基过多，同时产生炎症，使受损部位微环境恶劣，不利于神经细胞的修复^[2]。另外，脊髓损伤不同于其他部位的细胞与组织，受到损伤的神经细胞胞体属于高度分化的细胞，再生相关基因表达基本关闭，受损的轴突极易退变，这也加大了修复难度。^[3]

1.2脊髓修复材料的种类

对于脊髓损伤难以修复的内因——成熟中枢神经细胞再生能力不足的问题，目前主要采用的方法是通过移植干细胞实现神经元代替效应。而外因，即受损病灶细胞微环境恶劣，目前主要是通过构建有效的生物支架材料来改善细胞微环境以解决的，同时还可以向支架材料中加入活性因子，促进细胞的生长。

目前主要采用的生物支架材料包括可注射水凝胶材料以及预制成型支架材料。水凝胶普遍均为三维网状结构，主要以共价键与氢键相联，在充分交联以后，不仅可以在一定时间内维持一定的物理形态，部分水凝胶还具有一定的粘弹性。水凝胶的含水量一般可高达95%，且大多数为生物友好材料，可以通过水解或酶解来实现生物降解。用于脊髓修复的水凝胶在降解过程中，还可以为再生的神经组织提供空间。预制成型支架材料则在体外完成，而后借由手术放入受损组织处，主要适用于损伤严重的全横断或半横断模型。与水凝胶相比，这类支架最大的特点在于其本身为固态结构，其形貌，内部孔隙率等均可通过控制反应条件实现有效控制。另外，预制成型支架材料的模量远大于可注射水凝胶，降解速率也慢于水凝胶，这意味着预制成型支架材料的药物缓释时间长，结构支撑功能相对更强。

1.3壳聚糖的结构与性质

1.3.1壳聚糖的来源

壳聚糖藏于甲壳素之内。甲壳素是一种天然的生物高分子聚合物，来源广泛且成本低廉。将甲壳动物的外壳通过酸碱处理，脱去钙盐和蛋白质，就可以得到甲壳素。^[4]

甲壳素在化学结构上与植物的纤维素结构相似，被称为动物纤维素，将其脱乙酰化后就可以转换为壳聚糖。脱乙酰化是指从乙酰化的化合物上脱去乙酰基的反应过程。脱乙酰度是壳聚糖的重要质量评价指标之一，也是其生物活性评价及应用的重要参数之一。

1.3.2壳聚糖的结构

壳聚糖是一种由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖单体键和而成的一种多聚体。壳聚糖的某些基团，如氨基和羟基具有很高的设计性，可以通过化学原理进行调控，获得材料设计者所期待的性能，具有较高的化学通用性。

1.3.3壳聚糖的性质

壳聚糖具有良好的组织相容性和力学相容性，但血液相容性不良。^[5]

1.3.3.1组织相容性

壳聚糖与骨骼、牙齿、内部器官等生物体组织的相互适应性就称作是组织相容性。壳聚糖具有良好的组织相容性，在非心血管系统以外的受损组织与器官上应用时，受损部位依然可以保持生物活性，当壳聚糖应用于体内可以提高生物体的免疫活性。石明建等^[6]通过动物实验研究壳聚糖对小鼠免疫功能产生的影响，结果显示：壳聚糖在促进巨噬细胞的吞噬能力可以发挥较大的作用，并能够在一定程度上使脾脏抗体生成细胞的能力得到提升。除此之外，壳聚糖促进组织愈合和修复的功能也不容忽视。大量实验已经证明，壳聚糖在某种程度上可以促进上皮细胞的再生，通过介导细胞增殖而后使伤口愈合。吴德升等^[7]将壳聚糖充入硅胶管再生室中，套接于大鼠坐骨神经缺损处，以空白组对照。术后十六周，观察结果显示壳聚糖可促进再生轴突数目的恢复以及横断面髓鞘面积的增加。

1.3.3.2力学相容性

应用于人体组织的修复材料必须要具备一定的力学性能，以便于可以同时与周围组织实现同步，进而完成相应的生物机械性能。因此力学相容性是生物材料发挥作用的基础。而壳聚糖具有大分子链结构，刚性较强，拥有较高的强度和模量，力学相容性良好。另外，由于壳聚糖本身就存在很多可供反应的基团，因此在设计材料时还可以通过化学方法调节其分子量，借此来获得不同强度的壳聚糖衍生物以满足设计需要。

1.3.3.3血液相容性

研究表明，壳聚糖的血液相容性较差。由于壳聚糖自身具有聚阳离子电解质的特性，可以与血液中的成分发生不可逆化学反应，造成凝血等现象，因此其血液相容性极低，常作为止血材料。

1.4壳聚糖水凝胶的应用

壳聚糖无毒性，具有生物相容性和一定的抗菌性，可实现生物降解，在较多领域都有广阔的应用前景。

Leipzig ^[8] 在壳聚糖单通道导管内填充含神经前体细胞，实现壳聚糖水凝胶-生长因子-多元复合体系的构建。生物实验中体内28天的结果显示，在水凝胶交联过程中，固定于水凝胶结构中的活性分子可以通过诱导干细胞向所需要的细胞类型分化 ，形成类似中枢神经系统在胚胎发育初期形成的神经管结构 。

Li^[9]课题组向壳聚糖导管内填充负载神经营养因子，将制备的材料植入大鼠全横断5 m m模型，通过神经营养因子的缓释营造适合于内源性神经干细胞存活和分化的微环境，诱导形成了类似初始神经突触网络的结构，作为中继站从损伤的神经传输神经冲动。

此外，Cheng 等^[10]设计了一种壳聚糖神经导管可以帮助轴突再生桥接损伤区，进而实现神经功能的恢复。在生物实验中，这种神经导管的植入有效实现了脊髓损伤小鼠运动神经功能恢复。

类似的应用还有许多，清华大学敖强^[11]采用特定的模具制备的用于脊髓损伤全横断模型的壳聚糖支架在动物实验上也取得了良好效果。

1.5贻贝的概述

贻贝是一种具有极强吸附力的海洋生物，通过足盘可以实现对材料表面的粘附，无论材料是疏水性还是亲水性，这种粘附都不会失效。

1.5.1贻贝的超强粘附性

经研究发现^[12]，贻贝通过足腺分泌丝足，丝足中含有多种蛋白质，主要为预聚胶原和线程基质蛋白，其中7～8种蛋白质分布在用于吸附材料表面，与材料直接接触的足盘中。足盘主要包括蛋白Mfp1～6，与固体的接触界面上主要分布的是两种蛋白质Mfp3与Mfp5，这两种蛋白质所含有的DOPA约为30%。目前已得到证实，DOPA的含量越高，其粘附性越强。同时研究进一步还发现，不只是DOPA、多巴胺这些本身含有儿茶酚结构的化合物具有较强的粘附性，如果利用化学方法，将儿茶酚结构引入某些聚合物形成类似侧链或支链后，这些聚合物也都具有较强的粘附性。因此，可以得出结论，儿茶酚结构是贻贝具有较强粘附性的来源。

1.5.2贻贝仿生

在已经确定了贻贝粘附性产生的机理后，近年来这种模仿贻贝粘附蛋白开发仿生聚合物粘附材料的方法受到了极大的关注。通过合成含有儿茶酚侧链的聚合物材料，让这些儿茶酚基团将材料固定在制定基材的表面是贻贝仿生模拟的主要方向。

1.6多巴胺的结构与性能

多巴胺，单体又名 4-（2- 乙胺基）苯 -1，2-二酚，同时具有儿茶酚官能团与氨基。儿茶酚基团使多巴胺在采用化学方法接枝到聚合物上时，可以使聚合物也具有较强的粘附性，实现改性。氨基的存在为接枝反应的发生提供了条件。早在2000年时，Carlsso就因发现了多巴胺是大脑中枢神经系统中一种重要的神经递质而获得了诺贝尔医学奖。

多巴胺在材料学科中发挥其优势主要是通过聚多巴胺来实现。有研究认为聚多巴胺的形成是单纯的化学聚合，反应方式分别为直接氧化聚合（多巴胺首先被氧化生成多巴胺醌，然后在发生氧化和聚合反应），反歧化交联（多巴胺醌与多巴胺发生反歧化反应，生成半醌自由基，最后交联）^[13，14]。也有研究认为聚多巴胺是通过很强的非共价键力结合在一起的。Hong 等^[15]通过高效液相色谱结合核磁共振氢谱分析 PDA 的反应过程，得出PDA的形成为非共价自组装和化学共价聚合的共同作用。

聚多巴胺的形成过程简单且不需要有机溶剂。2007年，Messersmith 等人验证多巴胺可以在碱性（pH=8.5）的水溶液中聚合，构成具备强粘附性的聚多巴胺膜。因为聚多巴胺中含有大批丰富的亲水性基团，因此聚多巴胺可以提高生物材料的亲水性，为疏水性生物材料的广泛使用提供了可能。聚多巴胺也可以固定药物和生长因子，在脊髓修复过程中，加入相应的活性因子或者药物，可以促进修复过程。最重要的一点，聚多巴胺能够提高材料的生物相容性，降低炎症反应，减弱血液的免疫反应，使其应用更加广泛。

1.7多巴胺的应用

Shin 等^[16]利用 PDA 改性后的聚( L-丙交酯-co- ε-己内酯) 表面调控成肌细胞(C2C12) 的细胞行为，提高了成肌细胞的黏附、铺展和增殖。Jeong 等^[17] 利用 PDA 对 PMMA 表面改性，提高了植入材料的生物结合，促进了角膜上皮细胞和角膜基质细胞的增 殖，并且没有过多地分泌炎性细胞因子。Yang 等^[18]利用 PDA对316L 不锈钢表面进行处理，促进了脐静脉血管内皮细胞的黏附、增殖、迁移和功能化，同时抑制脐动脉平滑肌细胞的黏附和增殖，提高了不锈钢的血液相容性。Zhong 等^[19]利用 PDA 对 TiO₂ 纳米管表面进行处理，得到了类似的结果，即促进内皮细胞的黏附和增殖，但抑制平滑 肌细胞的黏附和增殖，即实现表面对细胞的选择性黏附。

1.8柠檬酸概述

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