论文总字数：18691字

摘 要

碳点作为发光碳纳米材料家族中的一员，由于它特殊的光学性质，引起了许多中内外专家的关注。在本研究中以柠檬酸为碳源、乙二胺为氮源，通过对实验条件（水热时间、水热温度，柠檬酸和乙二胺摩尔比）进行优化，得出碳点的最佳制备工艺。碳点被用作血红蛋白光学传感器中的受体，这种光学传感器的制作原理通过碳点和血红蛋白之间的π-π相互作用发生荧光猝灭，掺氮碳点可以在0.5-5.5 μM的线性范围内选择性检测血红蛋白，检出限为0.25 μM。碳点-血红蛋白复合物表面的血红蛋白与叶酸发生相互作用，进一步发生荧光猝灭，碳点-血红蛋白复合物可以在10-300 μM的线性范围内选择性检测叶酸，检出限为1.56 μM。故建立了一种简便、灵敏、高选择性的检测血红蛋白和叶酸的方法。

关键词：碳点 血红蛋白 叶酸 荧光

Construction and application of hemoglobin and folic acid sensor based on nitrogen-doped carbon dots

Abstract

As a member of the luminescent carbon nanomaterials, carbon quantum dots have been attention to many Chinese and foreign experts due to its special optical properties. In this experiment, the carbon source is citric acid; and ethylenediamine is used as the nitrogen source. The optimum preparation process of carbon quantum dots was obtained by optimizing the experimental conditions (hydrothermal time, hydrothermal temperature, citric acid and ethylenediamine molar ratio). The carbon dots are used as acceptors in hemoglobin optical sensors. The fabrication principle of this optical sensor is fluorescence quenching through the π-π interaction between the carbon dots and hemoglobin. The detection limit of hemoglobin is 0.25 μM, which can be selected in a linear range of 0.5-5.5 μM. The hemoglobin on the surface of the carbon-hemoglobin complex interacts with folic acid and further fluorescence quenching. The carbon-hemoglobin complex selectively detects folic acid in a linear range of 10-300 μM with a detection limit of 1.56 μM. So a simple, sensitive and highly selective method for detecting hemoglobin and folic acid was established on account of fluorescence quenching principle.

Key Words：Carbon dots; Hemoglobin; Folic acid; Fluorescence

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 2

1.1引言 2

1.2碳点 2

1.3 碳量子点的合成 3

1.3.1自下而上法 3

1.3.2自上而下法 5

1.4碳点的性质 6

1.4.1碳点的光学性质 6

1.4.2碳点的毒性和生物相容性 6

1.5碳点的应用 7

1.5.1金属粒子探针 7

1.5.2生物成像 8

1.5.3生物分子检查 8

1.5.4其他应用 8

第二章 实验部分 9

2.1实验材料与仪器 9

2.1.1仪器与试剂 9

2.2实验过程 10

2.2.1掺氮碳点的制备 10

2.2.2碳点的表征 10

2.2.3碳点量子产率的测定 10

2.2.4对血红蛋白的检测条件 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1结果与讨论 12

3.1.1条件的优化和产率的测定 12

3.1.2碳点的表征 13

3.1.3碳点的光谱性质分析 14

3.1.4离子强度对碳点荧光强度的影响 16

3.1.5碳点对血红蛋白和叶酸的检测 16

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致谢 27

第一章 文献综述

1.1引言

自从碳点在2004年被发现以来，它已经成为一种很受欢迎的碳纳米材料，并且已经有数以百计关于碳点的独特合成方法与性质的论文被发表^[1]。碳点是一类尺寸小于10 nm，可稳定均匀分布在溶剂中的类球形新型碳纳米材料。碳点的主要合成方法可分为两种方法：自上而下和自下而上。自上而下的方法是指从较大的碳骨架上剥离形成碳点的方法，包括电弧放电法，激光消融法和电化学法等。自下而上的方法是指通过利用分子或者离子等尺寸很小的碳材料合成出碳量子点的方法，例如，燃烧/热解法，模板法，微波法，水热法^[2-4]。近年来，荧光方法因为它的简易性，高灵敏度，实施迅速和低成本，已经吸引了生物传感领域的许多研究人员的关注。血红蛋白是细胞内运输氧的特殊蛋白质，叶酸是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。所以检测血红蛋白和叶酸的含量对人体健康很重要，并且检测叶酸和血红蛋白还可以诊断阿尔兹海默病^[5]。因此，基于掺氮碳点对血红蛋白和叶酸传感器的构建就显得十分有意义。

1.2碳点

2004年Xu等人^[1]在对单壁碳纳米管进行的一系列实验中偶然发现碳点，在此之后，吸引了许多中内外学者对碳点的荧光特性的研究并将其运用于医疗，材料等各个方面，并因此开创了一个新兴研究领域：荧光碳纳米材料。碳点的尺寸一般小于10 nm，主要由非晶态的纳米晶构成的准球形纳米粒子。Baker^[6]课题组对由烟灰蜡烛所得到的碳点进行核磁共振表征，证实了碳点由sp²/sp³碳构成的共轭系统。碳点由于表面存在大量的-COOH，因此特别容易溶于水和与许多无机物，有机物，生物物种表面功能化的特性。一般来说，通过硝酸的氧化处理就能将羧基引入碳点表面。

1.3 碳量子点的合成

1.3.1自下而上法

1.水热法

Gopi Kalaiyarasan等人^[7]将0.5 g胆固醇溶于5 mL乙醇和25 mL去离子水的混合物中，然后再小心地将该溶液转移至50 mL高压釜中。通过鼓风恒温烘箱以180 ℃的温度恒温加热8小时，加热速率为3 ℃/min。8小时后，使高压釜冷却至室温。然后经过过滤透析纯化，得到高产率的碳点。Chunduri等人^[8]将椰子的外壳和100 mL去离子水混合物装入200 mL高压釜中并通过鼓风恒温烘箱以200 ℃的温度恒温加热3小时。待高压釜中溶液在室温中自然冷却后，通过一系列后处理以获得固体碳点。最后用去离子水稀释碳点原液使其浓度为0.5 mg/mL，再将该浓度的碳点用于所有表征以及后续实验。Chunduri合成的碳点量子产率计算为6.9%。Tyagi和同事^[9]把前期处理过后的柠檬皮样品放入反应釜中，在鼓风恒温烘箱以200 ℃下恒温加热12小时。使釜在室温下自然冷却，然后收集样品并用二氯甲烷洗涤以除去未反应的有机部分。将得到的水溶液以10000 rpm离心30分钟，并从中分离溶剂，最后在100 ℃下干燥得到碳点。

2.微波法

丁莉芸课题组^[10]采用一步法微波合成碳点，将柠檬酸和尿素分别以12:8、9:8、6:8和4:8的比例混合，用搅拌器将该混合液溶解于10 mL水中，将溶液放入微波炉中加热4分钟，经完全蒸发后得到碳点固体，最后，用TG16-WS高速离心机以9000 r/min的速度离心10 min，用0.22 μm滤膜过滤，除去大颗粒。为了找出最佳合成时间，放入微波炉中加热时间分别为3 min、4 min和5 min时，然后研究了碳量子点（叶酸:尿素质量比为6：8）的荧光特性。Daily Rodríguez-Padrón课题组^[11]在反应之前，从葡萄牙中北部地区的纸浆和造纸工业获得的木质纤维素残余物在行星式磨机中以900 rpm的速度研磨10 min。随后，使用1 g经研磨的木质纤维素残余物，20 mL二甲基甲酰胺和0.1 g固体酸催化剂，在微波模型中以100 ℃下恒温加热2 h进行碳点的制备。 将所得溶液在室温下冷却，然后离心，过滤并在真空下干燥24小时，之后获得碳基荧光纳米颗粒。Yujin Choi课题组^[12]通过使用浴超声波仪(300W)的短暂超声处理将3 g柠檬酸（CA）和6.88 g 4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺(TTDDA)溶解在10 mL去离子水中。用聚乙烯包装膜松散地覆盖烧瓶顶部后，将含有CA和TTDDA水溶液的250 mL烧瓶在700 W家用微波炉中微波加热5 min，得到深棕色固体，然后再经过一系列后处理得到CDs粉末。

3.模板法

模板法是一种不同于水热法制备碳点的方法，通过联合结构指导作用和空间的局域作用对碳点的结构进行调节与控制。2009年，Liu等^[14]以可溶性酚醛树脂为碳源，将两性三嵌段聚合物F127（分子式为EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆，EO表示环氧乙烷，PO表示环氧丙烷）修饰二氧化硅微球作为模板，在惰性气体氛围下经高温处理，待其冷却后经过一系列细心地实验操作得到量子产率为14.7%的碳点。

4.燃烧法

He等^[15]报道了通过燃烧法来制备碳点。他们通过把薄薄的铝片放在点燃的蜡烛上面来收集燃烧所得的细小颗粒物，再在细小颗粒物中加入浓HNO₃进行加热回流，然后经过一系列后处理得到碳点。Ray等^[16]对燃烧法制备碳点进行了更加深入研究,发现通过烟灰与浓HNO₃加热回流所制碳点的荧光产率并不会随着回流时间加长而增加。燃烧法制备碳点经济实惠，碳源原料容易得到，实验操作简便，无需钝化即可发光，但是所制备的碳点稳定性差，荧光量子产率不高。

1.3.2自上而下法

1.激光烧蚀法

Hu等^[17]实验中的有机溶剂是以二胺水合物，乙二醇胺和聚乙二醇混合所得。然后将石墨粉溶于有机溶剂中，再用激光照射该悬浊液制备碳点。本实验目的是探讨碳点性能与溶剂之间是否存在某种联系。研究结果表明碳点的发射波长随着有机溶剂的不同而发生改变。Li等^[18]用商业化的纳米碳材料作为碳源，分散在乙醇或者水中，用Nd:YAG激光照射该悬浮液，制备出荧光碳点。激光刻蚀法是通过调节激光器脉冲能量和时间来调控荧光量子产率和碳点粒径的手段。但该方法需要激光的照射，氧化以及钝化，并且实验所用到的仪器价格都十分高，不适合大规模投入生产。

2.电化学合成法

电化学合成法是通过电解碳材料合成碳点的方法^[19]。Zhou等首次通用多壁碳纳米管作为正极制备出碳点，他们在实验中的电解质是四丁基高氯酸铵和乙腈的混合溶液，溶液在电解过程中颜色逐渐变深，所得溶液在365 nm紫外光激发下发出蓝色荧光且得到形态稳定、分布均匀，荧光量子产率为6.4%的碳点^[20]。

3.化学氧化法

Peng等^[21]在沥青基碳纤维中加入浓硝酸和浓硫酸的混合溶液（体积比1：3）并且超声2 h，再在高温下搅拌24 h，然后经过冷却稀释，调节pH透析获得碳点，并且成功的应用于细胞成像。

1.4碳点的性质

1.4.1碳点的光学性质

1.上转换荧光

Shen等^[22]发现通过浓硫酸处理过后的石墨烯量子点，再经过钝化处理，激发波长从600 nm变到800 nm时相对应地发射波长发生红移，并且在上转换过程能量几乎不变，所以他们推测上转换光致发光是反斯托克斯跃迁过程。当л轨道电子被一系列低能量光子刺激而激发到一个高能量状态，然后电子回到低能量状态并伴随上转换光致发光的产生。

2.激发独立性

荧光碳点与半导体量子点都具有激发波长在很长范围内都连续不断的性质。碳点被单独一激发光源激发可发出许多不同发射波长的荧光，进而达到单一激发源激发得到多元发射的效果。许多碳点随着激发波长的变化，其发射峰会相应地发生红移或蓝移且荧光强度也会发生变化，说明了激发依赖性。我们可以通过掺杂化学元素或控制其粒径大小，得到具有不同发射波长的荧光碳点。

1.4.2碳点的毒性和生物相容性

碳点因其粒径小穿透力强及优异的光学特性等优势在细胞成像，体内疾病探测等方面具有很多的应用空间，因此我们对碳点毒性研究就成为将碳点运用于细胞成像和体内疾病检测的重要指标。通常情况下，荧光材料具有的毒性会影响生命体和细胞的活性，甚至会导致生命体和细胞调亡。因此，判断一类荧光材料是否能用于活体或活细胞成像实验，必定首选毒性低的荧光材料。因为半导体量子点具有优异的光学性能，所以在活体和活细胞光学成像领域有着广泛应用。但是越来越多的研究发现，由于半导体量子所含的有毒重金属成分在体内会释放出有毒重金属离子，即使浓度很小，也会对细胞产生毁灭性伤害^[23,24]。大量的实验数据表明碳点具有很好的生物相容性而且毒性低，可以用于生物成像的研究中^[25]。除此之外，碳点表面含有丰富的功能性基团，经过有机化合物，无机化合物和具有生物活性的酶对其表面的修饰后，其荧光性能和量子产率能够得到大幅度提升。

1.5碳点的应用

碳点由于其优异的生物相容性和荧光特性，很低的毒性，制备的原料易得而成为研究热点。 它们已被广泛用于许多领域，包括光学感应材料和生物化学方面的分析检测。近年来，因为碳点表面功能化修饰技术和制备方法的不断改进，碳点的生物相容性及水溶性等性能得到提高，并在生物成像，光催化，信息加密与防伪，药物载体及疾病治疗，LED照明器件等领域已取得重要进展^[26]。

1.5.1金属粒子探针

碳点表面因为有许多的-COOH和-OH，特别容易与金属离子发生作用，表现为碳点的荧光强度猝灭或增强。碳点作为一种新型的金属离子荧光探针，能够高灵敏度的检测出金属离子，并在一定范围内对金属离子进行痕量分析，进而应用于实际环境中重金属粒子的检测^[27]。Sun等^[28]以二甘醇胺为纯化剂，一水合柠檬酸为碳源水热制备碳点，并将其首次应用于铁离子的定量分析。铁离子在5.0×10^-5-5.0×10^-4 mol/L浓度范围内与碳点荧光强度呈线性关系，检出限为11.2 μmol/L。Karfa等^[29]制备的碳点是以氨基酸为碳源，对铁离子有较强的荧光猝灭作用，在6.0-250.0 μg/L呈线性关系，检测限为3.0 μg/L。此外，碳点也被广泛应用于Pb² , Ag , Co² , Hg² 等其他金属离子的检测。

1.5.2生物成像

Sun课题组^[30]将MCF-7细胞放入含有碳点的培养皿中培养2 h，并且在荧光显微镜中看到MCF-7细胞带有很强的荧光，进而第一次实现了碳点在细胞标记上的用途。Weng研究小组^[31]的复合碳点是采用的柠檬酸铵为碳源，甘露糖为修饰剂，经过一步热解法所制备。碳点的粒径尺寸为1.97-4.37 nm,荧光量子产率达到9.8%。因为甘露糖和大肠杆菌K12菌株1型菌毛上的FimH凝聚素能发生特异性反应，所以野生型大肠杆菌能被碳点特异性识别，进而实现细胞成像。

1.5.3生物分子检查

Trang等^[32]用电子天平称取0.4 g柠檬酸和移液枪移取270 μL乙二胺共同加入到蒸馏水中，在室温下超声溶解。接着将该溶液转移至密封反应器（200 mL）并在200 ℃下恒温加热4 h。加热结束后，将反应器自然冷却至室温，再将棕红色且透明的产品进行透析以获得纯净的碳点。将血红蛋白和碳点溶液混合即得到不同浓度碳点-血红素复合物。碳点-血红素复合物可以在一定范围内选择性检测人体中的胆固醇。

1.5.4其他应用

其实，碳点除了在光催化，发光材料，生物成像，离子探针等方面的应用，还在荧光墨水^[33]，光电装置^[34]，生物医疗^[35]等方面有应用价值。

第二章 实验部分

2.1实验材料与仪器

2.1.1仪器与试剂

表2-1 实验仪器

Table2-1 Experimental instruments

表2-2实验试剂

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