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Glen报告

在最近的五篇Glen报告中，我们已经讨论了寡核苷酸脱保护的几个方面。 我们希望这一系列文章将对核酸合成方面的新手或是经验丰富的人都有所帮助。 新手将会在第1卷第2页找到很多有用信息，经验丰富人可以参考第3卷第6页。 第4页的第2卷将对所有RNA合成人员都有用，而氢氧化铵的替代品可以在第7页的第4卷中找到。我们甚至添加了更多关于在有机溶剂中的柱上去保护的研究型文章 以下是文章的目录。

第1卷 -完成脱保护

第2卷 - RNA脱保护

第3卷 - 含染料的寡核苷酸

第4卷 - 氢氧化铵的替代物

第5卷 - 有机溶剂中寡核苷酸的柱上脱保护

第1卷 -完成脱保护

介绍

本文提供了很多实用的信息，将帮助新手进入寡聚合领域，综合各种因素来选择最佳脱保护策略，以及可用于脱保护的多种途径。 文章不是对寡核苷酸合成中脱保护的全面描述 – 这些内容仅仅作为参考。 有关更多详细信息，请参阅Beaucage和Iyer的review1。 这是一系列关于脱保护的文章中的第一篇，将在我们的网站上公布。

寡脱保护可以分为三部分：切割，磷酸脱保护和碱脱保护。 切割是从固相载体中切下核酸分子， 磷酸脱保护是从磷酸酯骨架除去氰基乙基保护基团。，碱脱保护是去除碱或改性剂上的保护基。 当进行脱保护时，有很多考虑，如右图所示。 但是，在考虑可用来脱保护寡核苷酸的程序时，必须注意主要考虑因素：首先，不要破坏结构。 然后，可以继续到脱保护完成。

首先，不能破坏结构

确定适当的脱保护方案应从对寡核苷酸组分的介绍开始，以确定任何组是否对碱基敏感，并需要温和的去保护或者是否有任何预处理要求。敏感组件通常是昂贵的组件，所以必须按照我们推荐单独组件完成脱保护程序。例如，染料如TAMRA或HEX的存在将需要与常规未修饰的寡核苷酸不同的程序。类似地，含有基础不稳定单体（如5,6-二氢-dT）的寡聚物必须根据产品插入物（分析报告，分析证书或技术公报）中记载的程序进行处理。有时，某些产品需要特殊的预处理才能防止不必要的副反应。例如，氨基改性剂使用特殊的二乙胺预处理来提高氨基标记的寡核苷酸的总产率。如果寡核苷酸有几个不寻常的成分，你必须遵循推荐的最温和的程序，是的，事情可以快速复杂化。第2卷将重点介绍这个复杂的主题。

RNA脱保护是独特的，因为在切割和碱基脱保护期间必须保留2#39;保护基团。 然而，2#39;-OMe-RNA和2#39;-F-RNA在脱保护期间与DNA几乎相同。 但是，如果是杂交寡核苷酸或者包含了单个的RNA（除了3#39;-核糖核苷连接之外），则寡核苷酸必须被视为RNA。 请参阅适当的RNA脱保护方案：

http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR19-22.html http://www.glenresearch.com/Technical/TB_TOM.pdf

另一个潜在的考虑因素是在纯化之前寡聚溶液真空浓缩期间三苯甲基的损失，这将降低产物产率。 在蒸发期间，应该将真空浓缩器的热量关闭，以避免DMT组的损失。 应当注意，大多数DMT-on纯化方案，包括Poly-Pak TM和Glen-Pak TM，不需要在纯化之前蒸发去保护溶液。

潜在危害特殊情况是含有被MMT保护基保护的5#39;-胺的寡核苷酸（例如，10-1906）。 在这种情况下，脱保护不应在37℃下进行，以避免MMT组的热损失。

切割

在Applied Biosystems的经典合成仪上，在脱保护之前，可以在机器上单独进行寡核苷酸从合成载体的切割。 因此，许多研究人员仍然分别进行裂解反应，因此在每个脱保护部分的开始处提及所需的时间。 然而，大多数研究人员进行一步裂解/去保护反应，其优点是确保最佳产率。 该策略的唯一缺点是，升高温度下的碱性溶液会溶解少量的二氧化硅，如果去保护溶液蒸发至干，则白色不溶性残留物将显而易见。 然而，通过过滤，脱盐或任何纯化程序容易除去任何残留的硅酸盐。

脱保护的完成

寡核苷酸合成中的速率决定步骤更可能是去除G碱基上的保护基团。 忽略这一点，因为传统上寡核苷酸表现不佳的最常见的原因之一是存在最终产物寡核苷酸中的少量G保护基残留。 色谱方法可能会错过G保护基团的存在，但这些可以通过质谱分析容易地显示出来。 寡核苷酸脱保护的优点和缺点是什么？

常规脱保护

如果单独进行，用浓氢氧化铵（28至33％NH 3水溶液）进行裂解反应通常在室温下被认为是1小时。 使用氢氧化铵的脱保护是最传统的方法，可以追溯到寡核苷酸合成的最初阶段。 使用氨气饱和的氢氧化铵的关键问题之一是保持溶液新鲜。 我们将氢氧化铵分装并储存在冰箱中，适用于1周内使用。 不能过期使用氢氧化铵，因为所得的寡核苷酸不会被完全去保护。

超快速脱保护

使用UltraFAST方法，使用作为氢氧化铵和甲基氨水溶液的1:1混合物（v / v）的AMA2进行寡核苷酸从载体的切割。 如果单独进行，则在室温下5分钟内完成。

使用AMA，UltraFAST脱保护可使5-10分钟的寡核苷酸脱保护。 重要的是要注意，如果使用Bz-dC，UltraFAST系统需要乙酰（Ac）保护的dC以避免在C碱基的碱基修饰。 其他三种单体保持不变，并且该系统与iBuI，Ac-或dmf-dG同样良好，最后是我们优选的dG亚磷酰胺。

脱保护步骤在65℃下进行5分钟。 脱保护也可以在较低的温度下进行，在所有情况下，没有观察到碱改性。

超温和脱保护

使用UltraMILD技术时，不能直接进行切割。 由于我们的许多核苷和染料产物对于用氢氧化铵或AMA去保护都不稳定，所以必须改变去保护程序。

我们比较推荐使用UltraMILD单体（Pac-dA，Ac-dC和iPr-Pac-dG），并用碳酸钾在甲醇中脱保护。以这种方式，这些非常敏感的寡核苷酸中的一些可以方便地分离。如果使用含有苯氧基乙酸酐的Cap A进行封端，则可以在室温下用0.05M碳酸钾在甲醇中的4小时内将UltraMILD寡核苷酸脱保护，或者在室温下用氢氧化铵将其去除2小时。或者，使用含有乙酸酐的常规Cap A，需要在室温下去保护过夜以除去在封端步骤期间形成的任何Ac-dG。对于含有TAMRA的寡核苷酸，替代的脱保护3可以使用叔丁胺/甲醇/水（1:1:2）在55℃下进行过夜。我们发现在60℃下使用叔丁胺/水（1：3）6小时的另一个选择。在这种情况下，可以使用单体上的规则保护基。一个更温和的方法被描述为“UltraUltraMild”.4在这种技术中，Q-supports5与UltraMild单体允许非常温和的去保护。合成完成后，将固体支持物干燥并在含有10％（v / v）二异丙胺（iPr 2 NH）的0.25M硫代乙醇的MeOH溶液的55℃下处理过夜。

总结

成功的寡核苷酸切割和脱保护需要考虑每种产品的去保护条件，一些产品可能需要预处理或特殊去保护条件。 应检查每个合成物，以确保产品具有相容的脱保护条件。 我们的分析报告，分析证书，技术公告和网站：http://www.glenresearch.com可以找到特殊的脱保护要求。

第2卷 - RNA脱保护

介绍

在本系列“脱保护”（Glen Report 20.2）的前一篇文章中，我们专注于完成必要的脱保护。 在本文中，我们将注意力集中在RNA脱保护。 再次，这不是对该主题的全面描述。 相反，我们正试图提供一个统一的去保护策略，这对于RNA合成神秘艺术的新人来说很简单，同时以最小的方式生产纯的，活性的RNA寡核苷酸。 在适当的情况下，我们将提及其他合适的技术，但仅供参考。 同时，我们详细的RNA脱保护技术公报也已更新，可通过以下链接在我们的网站上找到：

TBDMS保护RNA：http://www.glenresearch.com/Technical/TB_TBDMS.pdf

TOM保护RNA：http://www.glenresearch.com/Technical/TB_TOM.pdf

RNA和嵌合DNA / RNA寡核苷酸的脱保护是独特的，因为需要在裂解期间保留2#39;保护基，磷酸盐脱保护和碱脱保护。 只有在寡核苷酸从载体上分离出来之后，从骨架中除去的氰基乙基和完全脱保护的碱可以完成2#39;脱保护步骤以产生完全功能的RNA。 但是，我们必须着重于我们的任务 - 首先，不破坏结构。

首先，不破坏结构

与DNA一样，存在于RNA寡核苷酸中的改性剂或染料将在很大程度上决定所需的RNA亚磷酰胺的类型，从而决定脱保护条件。 为了您的考虑，我们提供三种类型的RNA单体，我们将在下面简要介绍：

TOM保护的RNA亚磷酰胺

这些单体表现出高耦合效率，并且在高通量情况下特别有用，因为它们在水分控制不完美的情况下表现更好。 高耦合效率允许制备非常长的RNA寡核苷酸（gt; 75mer）。 这些单体与使用甲胺的高速去保护技术相容。

TBDMS保护的RNA亚磷酰胺

这些是我们的主要成本/性能比的单体。 它们也与使用甲胺的高速去保护技术兼容。

超温和RNA亚磷酰胺

许多次要的RNA单体，改性剂和染料与侵蚀性去保护技术不相容，并且这些UltraMild单体将允许更温和的去保护条件。

任何下游纯化要求也将影响RNA在整个脱保护过程中的适当处理。 例如，DMT-on纯化，例如Glen-Pak RNA已经变得越来越流行用于纯化RNA寡核苷酸，特别是siRNA，因此所有去保护方案必须使DMT组保持完整以允许进行纯化。

切割

对于RNA寡核苷酸，我们不常规使用单独的切割步骤。 通过将支持物暴露于完全去保护条件，我们认为可以实现溶液中产物的最大产率。 任何溶解的二氧化硅将在RNA寡核苷酸所需的进一步去保护步骤中丧失。

完成脱保护

碱脱保护

在本文中，我们将着重于在升高的温度下使用氢氧化铵/甲胺（AMA）的常规碱基脱保护，我们已经证明对于TOM保护的和TBDMS保护的RNA是最佳的，以及使用氢氧化铵/乙醇的UltraMild脱保护 3：1）在含有碱性不稳定基团的寡核苷酸的室温下。 必须强调的是，所有这些方案都需要使用受保护的C单体.1,2我们以前推荐使用乙醇胺/甲胺水溶液（1：1）（EMAM）去保护TOM保护的RNA。 该脱保护方案对于长RNA寡核苷酸是优选的，但对于常规RNA寡核苷酸是不必要的。

UltraMild RNA去保护。

脱保护后，从载体上取出上清液，蒸发至干。 如果为了净化目的保留了DMT保护，

应使用氮气或压缩空气流蒸发溶液，以避免DMT组的任何损失。 从这一点起，必须保持无菌，无RNase的条件。

2#39;端脱保护

过去，我们已经描述了从2#39;-羟基去除甲硅烷基保护基的几种方案。 叔丁基氟化铵在THF（TBAF）中已广泛用于此目的，4为纯三乙胺三氢氟酸（TEA.3HF）。 基于TEA.3HF的鸡尾酒已经变得越来越常用，并且与沉淀和基于墨盒的下游加工方法兼容.5-7各种添加剂如三乙胺（TEA）缓冲原始方法中使用的纯TEA.3HF，其倾向于 去除DMT并在嵌合寡核苷酸中去除dA位点。 这些鸡尾酒也可以与Glen Research目录中提供的所有三种类型的RNA单体功能良好。 此外，必须注意的是，TBAF与Glen-Pak RNA纯化方法不兼容。

正丁醇沉淀

为了完成DMT脱离RNA的2#39;脱保护，将寡核苷酸完全重新溶解在无水DMSO中。 记住避免玻璃，并使用无菌或无RNase的聚丙烯，O型圈盖管用于此反应。 如果需要，将寡核苷酸在65℃下加热约5分钟，使寡核苷酸完全溶解。 加入TEA.3HF，充分混合，加热至65℃2.5小时。 冷却溶液，并通过丁醇沉淀。

保留DMT的纯化

由于在混合物中添加了TEA，DMT-On RNA的2#39;去保护作用稍有不同，有助于维持DMT。 然后将去保护的RNA淬灭并立即在Glen-Pak RNA盒上纯化。

将RNA完全重新溶解在无水DMSO中，如果需要，在65℃下加热寡核苷酸约5分钟，使寡聚完全溶解。 将TEA加入到DMSO / RNA溶液中，轻轻混匀。 遵循TEA.3HF，混合均匀，加热至65°C 2.5小时。 不要通过加入丁醇来猝灭鸡尾酒，而是向反应中加入1.75mL的RNA淬灭缓冲液（60-4120-XX）。 样品现在可以用于GlenPak RNA盒的纯化。

Glen-Pak纯化

Glen-Pak RNA纯化柱可以在一次执行中从40nm纯化到1.0mu;m量程合成，并且以两种形式呈现; 一个用于真空歧管，另一个用于一次性注射器。 Glen-Pak纯化的RNA寡核苷酸通常显示出90％至95％之间的纯度，并且对于1.0微摩尔合成，在50至80OD范围内产生。 一旦2#39;去保护溶液猝灭，立即将2mL溶液装载在适当制备的Glen-Pak RNA盒上，并按照Glen-Pak RNA程序。 在该程序结束时，将寡核苷酸在1.0mL RNase Free 1M碳酸氢铵/ 30％乙腈中洗脱并冻干至干。 碳酸氢铵是挥发性盐，但是可能需要从无RNase的水中除去过量碳酸氢盐的第二个干燥步骤。

RNA分析

使用传统的缓冲系统，通过离子交换HPLC精确分析Glen-Pak纯化的RNA会形成二级结构而受到阻碍。 使用高氯酸钠缓冲系统以及加热应使大多数寡核苷酸变性。

在纯度分析过程中避免二次

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