论文总字数：26049字

摘 要

丙丁菌(Clostridium acetobutylicum)在特定条件下，能吸附在特定载体上，并大量聚集，并以固定化的细胞的形式形成一个菌落“联盟”，也被成为biofilm(生物被膜)。这种以高密度固定菌体的存在方式，不仅增强细胞耐受性和代谢活性，同时也增强biofilm中菌体对环境压力的适应能力。

本课题组前期试验表明，敲除Spo0A基因后导致细菌无法形成生物被膜，但是并没有深入研究。本研究对ΔSpo0A菌株进行回补表达Spo0A基因，进行了发酵产物分析、芽孢观察、胞外蛋白测定、浮游能力测试、生物量测定等实验。发现Spo0A基因不仅会恢复产醇能力、芽孢生成能力，在蛋白分泌、运动性、生物量的形成都会产生明显影响。

通过回补实验的结果进一步证明了Spo0A基因对丙丁菌biofilm的影响；多种表征实验的应用，也为丙丁菌表征研究提供借鉴。

关键词：丙酮丁醇梭菌 Spo0A因子 生物被膜

The complemented of Spo0A gene and characterization in ΔSpo0A of Clostridium acetobutylicum

Abstract

Under certain conditions, Clostridium acetobutylicum can be adsorbed on a specific carrier and aggregated in a large amount, forming a colony "alliance" in the form of immobilized cells, which is also called biofilm. This method of immobilizing the cells at a high density not only enhances cell tolerance and metabolic activity, but also enhances the ability of the bacteria to adapt to environmental stress in biofilm.

Our previous experiments showed that knocking out the Spo0A gene caused bacteria to form biofilm, but did not study it in depth. In this study, the ΔSpo0A strain was replenished to express the Spo0A gene, and the fermentation product analysis, spore observation, extracellular protein determination, plankton ability test, biomass measurement and other experiments were carried out. It was found that the Spo0A gene not only produced alcohol and spore-forming ability, but also had a significant effect on protein secretion, motility and biomass formation.

The effect of Spo0A gene on Probiotic biofilm was further proved by the results of the complementary experiment. The application of various characterization experiments also provides a reference for the characterization of butyl bacteria.

Key words:Clostridium acetobutylicum；Spo0A gene；biofilm

目录

摘 要.…………………………………………………………………………………………………….……………..…I

ABSTRACT……………………………………………………………………………………………………….…II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 生物被膜（biofilm）介绍 1

1.2.1 生物被膜 2

1.2.2生物被膜重要组分 2

1.2.3 生物被膜的功能 3

1.2.4生物被膜形成的影响因素 4

1.3 丙酮丁醇梭菌简介 4

1.4 Spo0A基因对成膜的影响 5

1.5 丙酮丁醇梭菌生物膜的表征手段 6

1.5.1芽孢观察 6

1.5.2平板浮游能力观察 6

1.5.3生物量测定 6

1.5.4胞外蛋白测定 6

第二章 材料与方法 8

2.1 材料 8

2.1.1 实验试剂和药品 8

2.1.2 实验仪器与设备 8

2.2 实验方法 12

2.2.1 菌株的活化与转接 12

2.2.2 质粒的构建 13

2.2.3发酵实验 17

2.2.4芽孢观察实验 20

2.2.5 蛋白含量的测定 20

2.2.6平板浮游能力测试实验 22

2.2.7生物膜量的测定 22

第三章 结果与讨论 24

3.1回补Spo0A菌株的构建 24

3.2时序成膜实验观察 25

3.3产物分析 25

3.4芽孢观察 26

3.5菌体的扩散能力实验 26

3.6生物膜量的测定 27

3.7pH调控下的发酵产物分析 28

第四章 结论与展望 31

4.1 结论 31

4.2 实验的不足与展望 31

参考文献 32

附录 35

第一章 文献综述

1.1 引言

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是以丙酮、丁醇、乙醇为主产物的厌氧发酵菌株，其发酵产物中生物丁醇是重要的可再生生物质能源，当今环境问题日益突出，可再生能源的利用必将受到重视^[1]。研究发现，丙酮丁醇梭菌拥有在特定载体上进行吸附聚集的能力，最终形成有一定厚度的胞外聚合物质EPS，EPS的存在极大增强了菌体的丁醇耐受性和菌株存活能力，能明显提高生产效率^[2]。目前国内外研究发现，Spo0A基因缺失对丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢杆菌等多种芽孢杆菌的芽孢生成均产生有效的抑制作用，而且该基因一定程度上影响菌体生物量及代谢产物的产量^[3]。本实验室拥有一株Spo0A基因敲除菌株，该ΔSpo0A菌株的产醇能力和产芽孢能力都受到影响。但是对于工业菌株丙酮丁醇梭菌来说，大量的研究集中于如何提高产物，如何提高底物利用率等，有关于如何进行丙酮丁醇梭菌生物膜形成实验的研究则较少。

本课题在敲除菌Spo0A基因的基础上，进行了Spo0A基因的回补表达实验和表征观察实验，这些实验包括发酵产物分析、芽孢观察、胞外蛋白测定、浮游能力测试、生物量测定。通过对比野生菌B3，ΔSpo0A以及Spo0A 基因回补菌三者表征上的变化，进一步增加了我们实验的可信性。综合表征实验结果，我们也发现了表达质粒回补特定基因的不足之处，当我们回补Spo0A基因进入ΔSpo0A中发现，Spo0A 基因回补菌仍然无法恢复到野生菌B3同等的发酵水平，说明通过质粒回补的方式带入目标基因并不是一种完美的手段。这些表征手段的应用和新的发现，都能给相关领域的科研工作者提供一些借鉴之处。

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