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摘 要

一个简单灵敏的高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）法得到开发和验证来测定大鼠血浆中的胡黄连苷I、II、III的血药浓度以及其药代动力学。色谱分离柱应用C18柱的梯度洗脱技术。该检测是通过实现采用三重四极杆串联质谱中负离子多反应监测（MRM）模式。校准所有三种分析中无论是血浆或组织匀浆曲线呈良好的线性

以上的0.5-500纳克/毫升与定量限在0.5纳克/毫升的浓度范围。提取回收率分别为gt;70％，相对基体效应范围从80.4％到所有的生物样品中的107.4％。所有的分析物都是稳定在室温下至少24小时，或冷冻21天，三个冷冻/解冻循环不会引起降解。该方法成功地应用于

在大鼠静脉内给药后的组织中测定血浆和各种三个环烯醚萜苷的浓度。胡黄连苷-I，II和III都淘汰迅速并且分布较广泛^[1,2]。并且胡黄连苷Ⅱ显示了最高的肝摄取，只有胡黄连苷-I和II被发现能够通过血脑屏障。这些结果形成其保肝或神经保护作用^[3]。随着药动学研究提供的可靠信息，LC-ESI-MS / MS^[4]同时测定提供了这三个环烯醚萜苷的治疗靶标，以及珍贵的临床适应症实验依据。

关键词：：LC-MS/ MS 胡黄连苷-I 胡黄连苷-II 胡黄连苷-III

Simultaneous quantification of three bioactive Iridoid Glycosides from Picrorhiza scrophulariiflora—Picroside I,Picroside II, Picroside III in rat plasma and tissues by HPLC–MS/MS: application to a pre-clinical pharmacokinetics and tissue distribution study

Abstract

A selective and sensitive high-performance liquid chromatography–electro-spray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) method was developed for the simultaneous quantitative determination of Picroside-I, II, and III in rat plasma and tissue homogenate to aid the pre-clinical studies^[5]. The chromatographic separation was performed a Hypersil GOLD AQ C18 column using a gradient elution program with a mobile phase of 2 mM ammonium acetate in water and acetonitrile.The detection was achieved by using a triple quadrupole tandem MS in negative ionization multiple reaction monitoring (MRM) mode^[6]. The calibration curves of all three analytes in either plasma or tissue homogenate showed good linearity over the concentration range of 0.5-500 ng/mL with a limit of quantitation at 0.5 ng/mL^[7]. The extraction recoveries of were gt;70%, and the relative matrix effect ranged from 80.4% to 107.4% ^[8,9]in all the biological samples. All the analytes were stable in matrices during room temperature at least for 24 h, or frozen for 21 days^[10,11]. Three freeze/thaw cycles did not cause degradation. The method was successfully applied to determine the concentrations of the three iridoid glycosides^[12,13] in plasma and various tissues after intravenous administration in rats. These results were consistent with their hepatoprotective or neuroprotective effects reported clinically. With the aid of the reliable simultaneous LC-ESI-MS/MS assay the pharmacokinetic^[14] study provided insights into their therapeutic targets of these three iridoid glycosides^[15] as well as valuable experimental basis for an expansion of clinical indications.

Key Words: LC-MS/MS; Picroside-I; Picroside-II; Picroside-III; Pharmacokinetics; Tissue distribution

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1竹节香附素A的基本性质 1

1.2药代动力学的意义 2

1.3 药代动力学参数及其应用 3

1.3.1生物利用度和生物等效性的概念及应用 3

第二章 材料和方法 4

2.1材料与仪器 4

2.1.1主要试剂 4

2.1.2主要仪器 4

2.2标准溶液和质量控制（QC）样本的制备 4

2.3样品预处理 5

2.4仪器和LC-MS/MS分析条件 6

2.5方法学验证 9

2.5.1特异性 9

2.5.2线性和最低定量限（LLOQ） 9

2.5.3精密度和准确度 10

2.5.4稳定性和稀释 10

2.5.5残留效应 10

2.6药代动力学和统计分析 10

第三章 结果与讨论 12

3.1质谱和色谱条件的优化 12

3.2样品预处理 12

3.3方法学验证 13

3.3.1特异性 13

3.3.2标准曲线和LLOQ 18

3.3.3提取回收率和基质效应 18

3.3.4日内及日间精密度和准确度 19

3.3.5稳定性，稀释和结转 20

3.4药代动力学的应用 20

3.5组织分布研究 22

第四章 结论 25

参考文献 26

致谢 28

第一章 文献综述

胡黄连为我国传统中药，最早记载于《唐本草》，具有清湿、凉血、燥湿、消疳功效¹。化学成分主要分为三类：环烯醚萜类、葫芦素类和酚苷类。胡黄连苷Ⅱ是环烯醚萜类的主要有效成分。据报道，胡黄连苷Ⅱ主要有保肝利胆、抗炎平喘、保护神经、免疫调节等药理作用。

目前国内外对胡黄连苷Ⅱ的药代动力学方面报道较少，有关于组织分布及排泄方面的报道几乎没有。与目前所报道的文献相比，HPLC-MS具有灵敏度较低，样品处理方法简单，分析时间较短等优点。

1.1胡黄连苷的基本性质

胡黄连为双子叶玄参科植物胡黄连(Picro-rhiza scrophulariiflora Pennell)的干燥根茎。产于我国西藏、云南。胡黄连总苷为胡黄连药材的提取物,主要含有环烯醚萜苷类、酚苷类和葫芦素类化合物,其具有保肝利胆、抗炎抗病毒、降血脂、免疫调节等作用[2-7]。其中环烯醚萜类化合物中的胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ(picrosideⅠ、Ⅱ)为其主要有效成分,且含量丰富。受传统分析方法灵敏度的限制,文献中只对胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ单独静注给药后的药物动力学进行了初步研究[8-9],尚无口服与静脉给药后比较药物动力学的研究报道。本文作者利用高灵敏度、高选择性的LC-MS/MS法,对大鼠体内胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ的药物动力学行为进行了较为系统的比较研究,为胡黄连总苷的制剂开发和临床给药方案的制定提供试验依据^[16]。图1-1胡黄连苷Ⅰ(a)和胡黄连苷Ⅱ(b)的化学结构式^[17]1仪器与材料API 4000液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子化源(ESI)

图1-1 黄连苷-Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的化学结构

1.2药代动力学的意义

1.2.1药物代谢动力学研究在新药发现中应用

在设计新的化合物时，参考药物代谢动力学参数，分析药物结构对参数的影响，从中找出结构与代谢之间的规律，用以指导新化合物的设计与结构优化，发挥药物代谢动力学对新药设计的指导作用。

1.2.2药物代谢动力学在药理学研究中的应用

药物产生药理效应，必须分布到靶部位，维持一定的浓度，并与作用部位产生受体-药物相互作用，产生一定的效应。通过PK-PD研究可以探索药物的作用机制，机体内外环境因素对药物体内过程的影响，评价新药或新制剂开发研究的前景，也有利于研究药物治疗的个体差异^[18]。

1.2.3药物代谢动力学在制剂学研究中的应用

药物代谢动力学可以有效的评价和筛选药物剂型，为临床合理用药提供科学依据，保证临床用药的安全性。药物缓、控释制剂和靶向制剂已成为国内外为研究的热点，具有减少用药次数、维持稳定的有效治疗药物浓度、或靶向到效应部位和降低毒副作用的优点，通过对制剂代谢动力学研究，可有效的评价各种剂型是否达到预期的研究目的。

1.2.4药物代谢动力学在中药现代化中的应用

中药复方药物代谢动力学研究是中药现代化的重要组成部分，研究中药活性成分、组分、单方和复方体内吸收、分布、代谢和排泄动态变化规律，有助于阐明方剂组方原理。

1.2.5药物代谢动力学在毒理学研究中的应用

药物代谢动力学与毒性试验相结合，探讨药物毒性或不良作用发生和规律。药物毒代动力学作为非临床和临床试验间的桥梁，其主要任务是提供毒代动力学数据和比较全身暴露、毒性与时间之间的关系，重点解释毒性试验结果。结合PK试验结果，可求得有效浓度/中毒浓度的安全范围。

1.3 药代动力学参数及其应用

1.3.1生物利用度和生物等效性的概念及应用

生物利用度（BA）是指药物活性成分从制剂释放吸收进入全身循环的程度和速度，一般分为绝对生物利用度和相对生物利用度。绝对生物利用度是以静脉制剂（通常认为静脉制剂生物利用度为100％）为参比制剂获得的药物活性成分吸收进入体内循环的相对量；相对生物利用度则是以其他非静脉途径给药的制剂（如片剂和口服溶液）为参比制剂获得的药物活性成分吸收进入体循环的相对量。

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