论文总字数：16372字

摘 要

本论文采用高效气相色谱-质谱（GC-MS），对卵巢癌细胞内小分子代谢物进行检测，并对该方法进行考证。选择1,2-¹³C₂肉蔻豆酸作为内标，肉蔻豆酸甲酯为外标，对样品进行硅烷衍生化反应。主要考察了仪器精密度、方法精密度、样品提取衍生化稳定性、冻融稳定性，长期冻融稳定性几个指标，结果证明该方法符合生物样品分析的要求。代谢组学的研究有着现实意义，尤其在疾病诊断、治疗等方面有重要应用，随着代谢组学研究技术的不断进步, 其在临床及临床前研究中的应用也将更为广泛和深入,必将促进更多生物、医学问题的解决。

关键词: GC-MS 硅烷衍生化 稳定性验证 治疗疾病

The methodology study on the GC-MS assay of the small molecule 

metabolites in ovarian cancer cells

Abstract

In this thesis, a simple and sensitive method of gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS) was used to detect the small molecular metabolites in ovarian cancer cells and to carry out research on this method.. Selecting 1,2-¹³C₂ as the internal standard of p-coumaric acid cinnamon, nutmeg bean acid methyl ester as external standard, which for the silane derivatization of samples. It mainly inspects the precision of the instrument, method precision, sample extracting derivatization stability, freeze-thaw stability, long-term freezing thawing stability index. The results show that these are consistent with the requirements of biological sample analysis. Studying on metabonomics has a practical significance, especially in the treatment of the disease, with the continuous progress of metabonomics research and technology, its application will also be more widely and deeply in clinical and preclinical studies and it will promote the more biological and medical problems to solve. However, the research of the metabolic group is still in the stage of development, and there are still many problems to be resolved..

Keywords: GC-MS;Silane Derivatization of Samples;Stability Verification;Treatment of Disease

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1代谢组学 1

1.2 代谢组学的研究方法 1

1.3代谢组学方法在疾病方面的应用 2

1.4总结 3

第二章 材料与方法 4

2.1实验材料 4

2.1.1实验试剂 4

2.1.2主要仪器 4

2.1.3细胞样品的制备 5

2.1.4 样品溶液的配置 5

2.2 实验方法 5

2.2.1细胞样品前处理方法 5

2.2.2 GC-MS分析条件 5

2.2.3 GC-MS数据采集和处理 6

2.2.4仪器精密度考察 6

2.2.5 样品提取衍生化稳定性 6

2.2.6 方法精密度考察 6

2.2.7 冻融稳定性考察 7

2.2.8长期冻存稳定性 7

2.3统计学分析 7

第三章 实验结果 8

3.1 GC-MS检测分析卵巢癌A2780细胞的总离子流色谱图 8

3.2 分离鉴定的物质 8

3.3 仪器精密度考察结果 11

3.4 样品提取衍生化稳定性结果 12

3.5 方法精密度考察结果 13

3.6冻融稳定性考察结果 14

3.7长期冻存稳定性 16

第四章 讨论 18

参考文献 19

致 谢 21

第一章 文献综述

1.1代谢组学

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后，最近几年发展起来的热点学科。按照代谢组学研究的方向不同，可将代谢组学研究分四个层次：代谢轮廓分析；代谢物靶标分析；代谢组学；代谢指纹分析^[1]。

完整的代谢组学分析是采用核磁共振、液质联用、气质联用等高通量、高分辨率、高灵敏度的先进技术对生物样品（包括血、尿、组织、细胞等）中小分子代谢物的种类和含量进行检测分析，结合多元数据处理对获得的数据降维，挖掘关键信息，寻找潜在生物标志物，研究生物标志物与机体病变的相关性。

代谢组学研究致力于对生物样本中的所有代谢物进行定性与定量分析，当技术条件不能满足对机体内源性代谢物进行全部的定性定量分析时，可以只分析生物体中某一类性质相似的代谢物物质(如糖类、脂肪酸等)，这种研究方式也是目前代谢组学研究的趋势。

1.2代谢组学的研究方法

代谢组学研究就是要利用各种高通量分析化学方法对生物体液、细胞或组织进行系统分析，对其中的内源性小分子代谢产物的组成、含量及其随时间的变化进行检测、确定和定量，并利用模式识别方法对这种变化进行分类和预测， 进而确定相关的生物标志物，对机体的整体的生物学状况和功能做出评价。而用于代谢组学研究的实验技术手段几乎包含了所有的分析化学技术，其中NMR、 GC-TOF/ M S 和 UPLC-TOF/ M S 是最常用的 3 种检测技术^[2]。

NMR 是一种基于具有核磁矩的原子核在外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。NM R方法具有无损伤性，不会破坏样品的结构和性质，同时无偏向性，因而能够检测到在其里面的范围内的所有包含氢原子的有机分子。NM R 氢谱方法很适合研究代谢产物中的复杂成分，而且本身也是一种适合于定量的分析技术。

GC-M S 是另一种被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定的分析技术，具有 GC 的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性、 定量研究的有效工具。GC 一直以来都是植物代谢组学研究的优选方法^[3]。 由于 GC-M S 方法有相对丰富的标准谱图数据库（如NIST/ EPA/ NIH 数据库） 可供利用， 使检测者能够方便、 快捷地对所得代谢物进行鉴定^[4] 。

结合了HPLC强大分离能力和 MS 高灵敏度的LC-M S 技术既可进行定性测定又可进行定量测定，且与 GC-MS相比，基本不需要进行衍生化的前处理，其灵敏度、 分辨率和分析速度明显提高，分析时间的急剧缩短，因此被认为是最有前途的代谢组学研究技术之一。

1.3代谢组学方法在疾病方面的应用

进行代谢组学方法学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学方面, 综合运用促进了诸多生物、医学问题的研究, 使得代谢组学方法学研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用^[5～8]。

如Yang 等 ^[9] 利用 LC-MS 和偏最小二乘法差异分析法鉴定到 5 个慢性乙型肝炎引发的急性肝衰的诊断标志物,及早发现，有利于疾病的治疗。

Yang 等 ^[10] 利用1 H MAS NMR 和 PCA 研究表明人轻度肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)及重度肝癌与毗邻的正常肝组织在代谢物表达上有显著差异, 且轻度肝癌与重度肝癌之间也有显著差异,这对于肝癌的早期诊断很重要。

Paige 等 ^[11]利用 GC-MS 研究表明, 老年抑郁症可能与脂类、神经递质等的代谢改变有关; Weljie 等 ^[12] 利用1 H NMR对转基因风湿性关节炎小鼠进行了研究。此外, 在高血压^[13]、II 型糖尿病^[14] 、心血管病^[15]等多种疾病研究中, 代谢组技术也已得到广泛应用。

1.4总结

代谢组学（Metabolomics）是近几年兴起的一门新型学科，它通过采用液质联用、气质联用以及核磁共振等较高的分辨率、灵敏性的先进的分析技术平台，对多种生物样品中的小分子代谢物进行定性和定量研究，对获得的数据信息进行多维分析并结合模式识别方法，分析生物体在病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，从整体角度全面的定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统代谢图谱来揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状，并分析相关的代谢物与疾病发展的相关性，寻找和验证潜在的生物标志物。代谢组学在一些疾病发病机制的研究、疾病的早期诊断和药理药效的评价等方面已经有了广泛的应用，比如肿瘤、糖尿病、心脏病等重大疾病。

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