论文总字数：23857字

摘 要

刺五加皂苷B和刺五加皂苷E是刺五加中两种主要的生物活性皂苷，在生物学活性方面起关键作用。在这项研究中，开发并验证了具有特异性和高灵敏性的液质联用（LC-MS/MS）方法，同时检测大鼠血浆中刺五加皂苷B和刺五加皂苷E的浓度。

通过甲醇直接沉淀蛋白的方法提取大鼠血浆中的刺五加皂苷B和刺五加皂苷E，选择虎杖苷做内标（IS）。色谱分离通过梯度洗脱方法在C₁₈柱上完成，流动相由乙腈和0.1%氨水溶液组成，流速0.2 mL/min。使用LC-MS/MS对大鼠血浆中刺五加皂苷B和刺五加皂苷E的含量进行检测，采用ESI源，MRM负离子检测模式。刺五加皂苷B、刺五加皂苷皂E和IS的检测离子对分别为m/z 371 [M−H]⁻→ 209、m/z 741 [M−H]⁻→ 579和m/z 389 [M−H]⁻→ 277。

标准曲线的浓度范围是1–2000 ng/mL（刺五加皂苷B和刺五加皂苷E），定量下线为1 ng/mL。刺五加皂苷B和刺五加皂苷E的大鼠血浆提取回收率大于80%，批内、批间RSD值均低于12%，RE在-2.80−5.70%之间。本实验中，大鼠血浆中刺五加皂苷B和刺五加皂苷E的LC-MS/MS检测方法，成功应用到大鼠口服和静脉注射单一药物（刺五加皂苷B和刺五加皂苷E）的药代动力学行为的研究，更进一步的研究中比较了口服单一药物和刺五加水提物的药代动力学的差异。研究发现，大鼠体内单一药物（刺五加皂苷B和刺五加皂苷E）和刺五加水提物的药代动力学特征的存在显著性差异，这有利于刺五加的临床前研究和临床应用。

关键词：刺五加皂苷B；刺五加皂苷E；刺五加；LC-MS/MS；药代动力学

Abstract

Eleutheroside B and Eleutheroside E, two kinds of the major bioactive saponins of Eleutherococcus senticosus, play a pivotal role in biologic activity. In this study, a specific and sensitive high performance liquid chromatography–electrospray ionization-tandem mass spectrometry method (HPLC–MS/MS) was developed and validated for simultaneous determination of Eleutheroside B and Eleutheroside E in rat plasma. The analytes were extracted from rat plasma via a simple protein precipitation procedure with methanol and polygonin was used as internal standard. Chromatographic separation was achieved on a C18 column using a gradient elution program with acetonitrile and water containing 0.1% ammonium hydroxide solution as the mobile phase, with a flow rate of 0.2 mL/min. The detection was performed on a triple–quadrupole tandem mass spectrometer by multiple reaction monitoring (MRM) mode in a negative ion mode via electrospray ionization (ESI). The transition monitored were m/z 371 [M−H]⁻→ 209 for Eleutheroside B, m/z 741[M−H]⁻→ 579 for Eleutheroside E and m/z 389[M−H]⁻→ 277 for internal standard.

Linear calibration curves were obtained in the concentration range of 1–2000 ng/mL for both (Eleutheroside B and Eleutheroside E), with a lower limit of quantification of 1 ng/mL. Extraction recovery was over 80% in plasma. The intra- and inter-day precision (RSD) values were below 12% and accuracy (RE) was −2.80 to 5.70% at three QC levels for both. The assay was successfully applied to study pharmacokinetics behavior in rats after oral and intravenous administration of the single substances (Eleutheroside B and Eleutheroside E). And further research was performed by comparing the difference in pharmacokinetic behavior between the single substances and an aqueous extract of E. senticosus after oral administration. Significant difference in pharmacokinetic characteristics between the single substances and an aqueous extract was found in rat, which would be beneficial for the pre-clinical research and clinical use of E. senticosus.

Keywords: Eleutheroside B; Eleutheroside E; LC–MS/MS; Pharmacokinetics

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 刺五加的基本性质 1

1.2 刺五加皂苷B和E的基本性质 1

1.3 刺五加皂苷B和E的药理及药效作用 2

1.3.1 对心血管系统的作用 2

1.3.2 抗肿瘤的作用 3

1.3.3 调节糖代谢的作用 3

1.3.4 调节机体对非特异刺激反应性作用 4

1.3.5 对免疫功能的作用 5

1.3.6 镇痛的作用 5

1.3.7 抗衰老作用 6

1.4研究现状 6

1.5 药物代谢动力学的意义 7

1.5.1 药物代谢动力学研究在新药发现中应用 7

1.5.2 药物代谢动力学在药理学研究中的应用 7

1.5.3 药物代谢动力学在制剂学研究中的应用 7

1.5.4 药物代谢动力学在中药现代化中的应用 7

1.5.5 药物代谢动力学在毒理学研究中的应用 7

第二章 实验材料和方法 9

2.1 化学药品、试剂与仪器 9

2.1.1 化学药品、试剂 9

2.1.2 仪器 10

2.2 实验条件与方法 10

2.2.1 液相色谱条件 10

2.2.2 质谱条件 11

2.2.3标准溶液和质量控制（QC）样品的制备 12

2.2.4血浆样品处理方法 13

2.3 方法验证 13

2.3.1 特异性 13

2.3.2 标准曲线的制备及定量下限的测定 13

2.3.3 精密度和准确度 14

2.3.4 提取回收率与基质效应 14

2.3.5 稳定性 15

2.3.6稀释稳定性 15

2.3.7药代动力学研究 16

第三章 实验结果与讨论 17

3.1质谱和色谱条件的优化 17

3.2提取方法的选择 17

3.3方法验证 17

3.3.1特异性 17

3.3.2线性和定量下线 19

3.3.3精密度和准确度 19

3.3.4提取回收率和基质效应 20

3.3.5稳定性 21

3.3.6稀释稳定性和记忆效应 21

3.4药代动力学应用 22

第四章 结论 26

参考文献 27

致 谢 29

第一章 文献综述

1.1 刺五加的基本性质

刺五加，又名五加参、刺拐棒，是五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus (Rupr1 et Maxim1)Harms 的根和根茎，主要分布于东北、华北、陕西、四川及广西等地。 在我国本草医籍中均有记述，《本草纲目》称刺五加为“本经上品”。刺五加树皮作五加皮入药，叶、茎和果实也可作药用使用。该药性温、味辛、微苦、无毒，入脾肾经，具有扶正固本、补肾健脾、益智安神的功效。对脾肾阳虚，腰膝酸软，体恤乏力，失眠，多梦，食欲不振疗效优良^[1]。根据现代药理研究发现，刺五加中提取的天然活性成分之一就是刺五加皂苷，它是由糖或其衍生物的半缩醛羟基与另一非糖物质中的羟基以缩醛键脱水缩合而成的环状缩醛衍生物，从刺五加叶中分离出以齐墩果酸为配基或在齐墩果烷型配基上连有单糖链或双糖链的13种三萜皂苷，其中包括最先分离出的刺五加皂苷（A、B、C、D、E、F、G），以及从叶中分离到以齐墩果酸为配基的五加叶苷 I 、 K、 L 和 M 等，其中多以刺五加皂苷B和E作为其提取物测量标准^[2]。有研究报道，刺五加皂苷具有提高血浆地高辛的水平^[3]，对抗睡眠剥夺所引起的动物学习以及记忆能力的降低^[4]、延缓衰老^[5]甚至减肥^[6]等多种生物学作用，且对人体肝、肾功能无负面影响^[7]。

1.2 刺五加皂苷B和E的基本性质

刺五加总皂苷在刺五加植物的根和根茎中的含量分别占干药材重量的 0.6～0.9 %和 0.6 %～1.5 %。已分离出七种刺五加皂苷 ( A、B、C、D、E、F、G )，其中刺五加皂苷A为胡萝卜苷，刺五加皂苷B是紫丁香酚苷，刺五加皂苷B1结构为7-羟基-6 ,8-二甲基香豆精葡萄糖苷，刺五加皂苷C为乙基半乳糖苷，刺五加皂苷E是紫丁香树脂酚二糖苷，和刺五加皂苷D互为异构体，研究证明茎中刺五加皂苷B、E的含量高于根部。刺五加皂苷B为紫丁香素（syringin），是刺五加用来强身健体的有效成分，有促性腺、抗辐射、抗疲劳等作用，具有与人参皂苷相似的生理活性^[8]。

1.3 刺五加皂苷B和E的药理及药效作用

1.3.1 对心血管系统的作用

1.3.1.1 抗血小板聚集、血栓形成的作用

动物实验表明，刺五加茎叶提取液（乙醇提）对小鼠由胶原和肾上腺素所诱导的血栓形成有良好的保护作用。当刺五加用量为20.0 mg/kg时与生理盐水组相对照，使胶原/肾上腺素混合液诱导的小白鼠血栓死亡及麻痹持续时间降低56.8％^[9]。

通过耳缘静脉给家兔注射刺五加茎叶提取物，以耳缘静脉注射生理盐水为对照组。分别在给药前和给药后隔时从静动脉取血，分离出富含血小板血浆（PRP）和贫含血小板血浆（PPP），在富含血小板血浆中分别加入花生四烯酸（AA）及二磷酸腺苷（DP）等血液凝聚诱导剂，观察血小板聚集情况，与生理盐水组作对照，发现刺五加提取物(0.275-2.2 mg/mL)对花生四烯酸诱导的家兔血小板TXB2的生成有显著抑制作用，且抑制效应与剂量无关^[10]。

1.3.1.2 对心脏的作用

实验观察了急性心肌梗塞6 h后的犬相应心肌乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK) 活性以及游离脂肪酸(FFA)含量与注射刺五加皂苷(ASS)的影响关系，结果表明，刺五加皂苷(ASS) 25 mg/kg、50 mg/kg均能明显提高心肌中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK) 活性，而且有效降低游离脂肪酸(FFA)含量。实验表明刺五加皂苷(ASS)具有通过改善心肌代谢过程从而达到抗心肌缺血的作用。

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