论文总字数：20120字

摘 要

糖基化修饰核苷类药物可以显著地提高其药理活性。单一的β-半乳糖基核苷类似物能够在10%DMSO溶剂系统中有效合成，该溶液系统是由溶剂耐受的巨大芽孢杆菌YZ08中新分离出的溶剂稳定的β-半乳糖苷酶催化得到的。用于核苷类似物的半乳糖基化的最有效的糖供体是乳糖而不是硝基苯基糖苷。然而，它伴随着在繁殖系统中形成复杂的半乳糖基核苷类似物。本研究通过添加DMSO，不仅显著增加了β-半乳糖苷酶的稳定性，而且将复杂产物调节成单一的单半乳糖基核苷类似物，这可以显著简化后续分离的过程。值得注意的是，在10%DMSO中β-半乳糖苷酶与3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷的亲和力显着增强，并且催化效率 (κ_cat/K_m)与在溶液中的催化效率相比增加了一倍。这些结果表明，溶剂稳定的糖苷酶在生物合成以及通过调节反应溶剂系统来调节糖苷前药方面具有较好的应用潜力。

关键词：核苷类化合物 半乳糖基化 β-半乳糖苷酶 溶剂调控

High efficiency synthesis and product regulation of galactosyl nucleoside drugs

Abstract

Glycosylation of nucleoside drugs can significantly improve its pharmacological activity.Efficient synthesis of unitary β-galactosyl nucleoside analogues was successfully achieved in a 10% DMSO solvent system, catalyzed by a newly isolated solvent-stable β-galactosidase from solvent-tolerant Bacillus megaterium YZ08. The most efficient sugar donor for the galactosylation of nucleoside analogues was lactose rather than nitrophenyl glycoside. However, it was accompanied with the formation of complicated digalactosyl nucleoside analogues in the buffer system. The addition of DMSO not only prominently increased the stabilization of β-galactosidase but also regulated the products from complicated products to unitary monogalactosyl nucleoside analogues, which could significantly simplify the process of subsequent separation. Strikingly, the affinity of β-galactosidase to 3^’-azido-3^’-deoxythymidine in 10% DMSO was significantly enhanced, and the catalytic efficiency (κ_cat/K_m) was doubled as compared to that in buffer solution. These results indicated that solvent-stable glycosidase possesses attractive potency in biosynthesis as well as in regulation of the glycoside prodrugs by adjusting the reaction solvent system.

Key words:nucleoside compounds; galactosylated ;β-galactosidase;solvent regulation

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1核苷类药物治疗肝脏疾病的研究现状及发展瓶颈 1

1.2糖基化增强目标药物的靶向性作用 3

1.2.1易化性单糖转运体与糖苷化合物靶向作用 3

1.2.2 糖苷酶与糖苷化合物靶向作用 4

1.2.3半乳糖受体与糖苷化合物靶向作用 4

1.2.4核苷类药物糖基化修饰研究进展 4

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2 实验试剂与仪器 7

2.1.3 培养基 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 β-半乳糖苷酶BMG的制备 9

2.2.2 β-半乳糖苷酶活力的测定 9

2.2.3 一般反应条件的优化 10

2.2.4 亲水性有机溶剂对叠氮胸苷半乳糖基化反应的影响 11

2.2.5 BMG催化叠氮胸苷半乳糖基化反应的动力学分析 11

2.2.6 10% DMSO中酶法半乳糖基化核苷类化合物 11

2.2.7 核苷类化合物及其糖基化产物HPLC分析 11

2.2.8产物的分离、纯化及结构鉴定 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 BMG催化叠氮胸苷糖基化反应条件的优化 13

3.1.1糖基供体的选择 13

3.1.2反应pH的优化 13

3.1.3 反应温度的优化 14

3.1.4 乳糖浓度的优化 15

3.1.5酶添加量的优化 15

3.2非水相体系对叠氮胸苷半乳糖基化反应的调控 16

3.3BMG催化叠氮胸苷半乳糖基化反应的动力学分析 17

3.4 10% DMSO体系精确调控多种核苷类化合物半乳糖基化反应 18

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1核苷类药物治疗肝脏疾病的研究现状及发展瓶颈

研究数据显示，我国肝脏疾病高发，乙肝感染者的规模不断扩大，平均数据达到10%，在世界水平上已属高发区，更不容乐观的是，丙肝病毒的感染者也已超过千万。乙型丙型病毒是造成肝硬化以及肝癌的重要原因，在我国，每年死于病毒性肝炎及相关疾病的人数超过一百万，其中死因为肝癌的超过十万，从性别差异来看，肝癌依旧占据较高位置，在男女性癌症死亡人数中分别占据三四位。当前，病毒性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝癌等疾病的治疗的主要途径依旧是药物控制，也就是说，非手术治疗特别是药物治疗是当前医疗科技发展水平下治疗肝脏疾病最重要的方式。

在病毒性疾病和肿瘤等疾病的治疗过程中，核苷类药物的使用十分普遍^[1]。作为抗病毒药物，这类药物的作用靶点为RNA 病毒的逆转录酶或DNA 病毒的聚合酶，在竞争性作用于酶活性中心的同时嵌入正在合成的DNA链中，从而阻止DNA链的延长，最终抑制病毒复制。近年来，随着对核苷代谢过程中的酶以及核苷类药物的抗肿瘤和抗病毒机制研究的不断深入，核苷类新药的研发取得了长足的进展（表1-1）。特别是在抗肝病毒方面核苷类药物表现突出，核苷类药物由于其具有口服给药方便，抑制病毒作用显著，并且肝功能失代偿患者也能够使用的的特点，日益引起研究者的广泛重视，一系列核苷类抗肝病毒病毒药物相继开发(图1-1)。

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