论文总字数：20567字

摘 要

胃癌作为一种全球化的恶性疾病，在我国的发病率也相对较高。近年研究发现DNA甲基化检测可以作为胃癌早期的诊断手段，胃癌的发生与DNA甲基化密切相关。课题组通过建立人低分化胃癌的甲基化谱，发现相关基因骨形成蛋白（BMP3）的甲基化与胃癌关系密切。BMP3蛋白表达受到1,25-二羟基维生素D3的调控，探究1,25-二羟基维生素D3对BMP3蛋白表达的调控从而影响人低分化胃癌细胞，最终发现治疗胃腺癌的新方法。结果显示：通过建立人低分化胃癌甲基化谱，胃腺癌的发生确实与基因甲基化水平密切相关，其中BMP3基因差异最大。BMP3基因在正常人胃黏膜细胞中呈现高水平表达，而在人低分化胃癌细胞中低表达，该基因蛋白质表达受到甲基化水平影响。BMP3基因的过度表达能够促进低分化胃癌细胞的凋亡；1,25-二羟基维生素D3能够上调BMP3的表达，同时通过影响胃癌细胞增殖的S期达到抑制癌细胞增殖。

关键词：低分化胃癌 1,25-二羟基维生素D3 BMP3 甲基化

Effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on BMP3

Abstract

As a global malignant disease, gastric cancer has a relatively high incidence in our country. Recent studies have found that DNA methylation can be used as a diagnostic tool for early gastric cancer. The occurrence of gastric cancer is closely related to DNA methylation. In this study, the methylation profile of human poorly differentiated gastric cancer was established and related gene bone morphogenic protein (BMP3) was found. At the same time, because BMP3 protein expression is regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D3, it is explored that 1,25-dihydroxyvitamin D3 may affect human poorly differentiated gastric cancer cells through the regulation of BMP3 protein expression and finds new treatment for gastric adenocarcinoma. method. The results showed that the establishment of gastric adenocarcinoma methylation spectrum, the occurrence of gastric adenocarcinoma is closely related to the level of gene methylation, among which the BMP3 gene has the largest difference. BMP3 gene is expressed in high levels in normal human gastric mucosa cells but low in human poorly differentiated gastric cancer cells. The expression of this gene protein is affected by the level of methylation. The overexpression of BMP3 gene can promote the apoptosis of poorly differentiated gastric cancer cells; 1,25-dihydroxyvitamin D3 can up-regulate the expression of BMP3 and inhibit the proliferation of cancer cells through the S phase that affects the proliferation of gastric cancer cells.

Keywords: Poorly differentiated gastric cancer;1,25-dihydroxy vitamin D3;BMP3;Methylation

目 录

摘要.....................................................Ⅰ

ABSTRACT..............................................Ⅱ

第一章 文献综述 3

1.1 DNA甲基化 3

1.1.1甲基化对基因表达的调控 3

1.1.2DNA甲基化与肿瘤 3

1.2 骨形态发生蛋白（BMP3） 4

1.2.1BMP3 4

1.2.2 BMP3基因位置 4

1.2.3 BMP3功能 4

1.3 维生素D3 5

1.3.1维生素D3的来源 5

1.3.2维生素D3与骨质疏松 6

1.3.3维生素D3与肿瘤癌症 7

第二章 1，25-二羟基维生素D3水平影响肿瘤发生与发展 9

2.1 实验材料 9

2.2 样本收集、处理 10

2.2.1 样本收集 10

2.2.2 样本病理判断 10

2.3 细胞培养液配置 10

2.4 低分化胃癌细胞与正常细胞甲基化水平检测、对比 10

2.4.1 提取样本DNA 10

2.4.2 甲基化水平检测 11

2.4.3 甲基化数据分析 12

2.5 BMP3在胃癌细胞中的表达水平检测 12

2.5.1 样品处理 12

2.5.2 蛋白质定量 12

2.5.3 蛋白质的SDS - PAGE电泳 13

2.5.4Western印迹 14

2.6 将细胞系去甲基化 14

2.7 1,25-二羟基维生素D3处理细胞系 14

第三章 结果分析 15

3.1 人低分化胃腺癌甲基化谱的建立 15

3.2 BMP3在人胃粘膜细胞系中的表达 17

3.3BMP3甲基化对基因表达的调控 18

3.4 1,25-二羟基维生素D3对低分化胃癌细胞系BGC-823和SGC-79 19

3.5 1,25-二羟基维生素D3对人低分化胃癌细胞系中BMP3基因表达的影响 20

第四章 结论 22

4.1 低分化胃腺癌的发生和发展与DNA甲基化密切相关...............22

4.2 BMP3基因在正常胃组织细胞和低分化胃腺癌细胞中甲基化差异显...22

4.3 BMP3基因表达受到甲基化的调控...............................22

4.4 1,25-二羟基维生素D3对BMP3基因表达的上调作用..............22

第五章 展望 24

参考文献： 26

致谢 29

第一章 文献综述

DNA甲基化

1.1.1甲基化对基因表达的调控

DNA甲基化涉及表观遗传机制，将甲基从S-腺嘌呤甲硫氨酸转移到胞嘧啶的C5位形成5-甲基胞嘧啶，通过改变例如DNA构象、DNA稳定性、染色体结构和DNA与蛋白质相互作用等方面，调控相应的基因表达[1]。DNA甲基化本身可能通过损害转录激活因子的结合来降低基因表达。DNA甲基化过程：甲基被DNA甲基转移酶家族（Dnmts）催化，从S-腺嘌呤甲硫氨酸（SAM）转移至胞嘧啶残基的第五个碳以形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。（a）Dnmt3a和Dnmt3b是从头Dnmts，甲基（红）转移到裸DNA中。 （b）Dnmt1维持Dnmt并在复制期间维持DNA甲基化模式。 当DNA经历半保守复制时，亲本DNA保留了原始DNA甲基化模式（灰色）。 Dnmt1通过向新形成的子链（蓝色）添加甲基（红色），与复制位点上的原始DNA甲基化模式相关联并复制。 DNA甲基化可以参与多种细胞生物过程，并且对于维持机体的功能稳定性如胚胎发育，转录，染色质结构，X染色体失活，基因组印记和染色体稳定性是重要的[2]。

图1-1 DNA甲基化过程

1.1.2 DNA甲基化与肿瘤

肿瘤的发生与DNA甲基化密不可分，某些基因的甲基化状态可以作为肿瘤发生的生物标志物。基因组区域（包括CpG岛，CpG岸和第一外显子）的异常DNA甲基化与所有人类癌症的改变的基因表达模式特征有关[3]。DNA甲基化异常分为两种：高甲基化和低甲基化。首先来说说高甲基化，正常组织中原本不应该发生甲基化的位点发生甲基化；同时，低甲基化是指正常组织中甲基化位点发生去甲基化。基因启动子区域的Cp G岛发生高甲基化，会沉默基因转录，使得例如抑癌基因等重要DNA修复基因失去功能，这与多种肿瘤癌症的发生密切相关[4]。基因启动子区域中甲基化和甲基化的减少可使肿瘤抑制基因失活，从而导致肿瘤发展。

1.2 骨形态发生蛋白（BMP3）

1.2.1 BMP3

骨形态发生蛋白是转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一个大亚组[5]。 BMPs通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体发出信号，由I型和II型亚型组成，BMP3基因与成骨细胞和破骨细胞的形成和分化有关，诱导细胞分化，与骨，软骨及牙齿的形成有关[6]。已经存在许多的研究证明：BMP基因与肿瘤的形成密切相关，骨形态发生蛋白3（BMP3）已被证明在结肠直肠，胰腺，胃，肺和乳腺，癌症被甲基化。

1.2.2 BMP3基因位置

BMP3基因存在3个外显子，基因表达产生的BMP3蛋白具有472个氨基。基因位于4号染色体上，位置序列为4q21。

1.2.3 BMP3功能

BMP3也被称为成骨素，是几种成骨BMPs的拮抗剂，并且是骨密度的负面决定因素[7]，该基因在骨骼发育系统中起着重要作用。近期，越来越多的研究表明：在一般情况下，BMP存在抑癌作用，但是在少数癌症中会产生相反作用，促进癌症发展。随着癌症的恶化，BMP基因表达产物即BMP蛋白质含量呈下降趋势。目前，已有研究表明BMP3基因甲基化可作为低分化胃癌的检测标志，所以，在低分化胃腺癌的发生和发展中，BMP很可能同样起到抑癌作用。

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