文 献 综 述

1.脂肪酶概述

脂肪酶又称作三酰基甘油水解酶,是一类重要的水解酶, 由于其种类多，具有比动物脂肪酶更广的作用，且pH值、作用温度范围和对底物的专一性便于进行工业生产^【1】。脂肪酶得到广泛关注和研究在食品、皮革、医药和洗涤剂行业^[2]等许多工业领域中均有广泛应用^[3]。

随着现阶段人们对微生物的重视程度越来越高，有关微生物脂肪酶研究也不断深入．最近几十年，随着工业化应用对脂肪酶性质的不同需求，能够产生具有特定酶学性质的脂肪酶微生物种类不断增加，目前遍及酵母菌属、霉菌等．但大部分脂肪酶菌株的酶催化效率不高，对于脂肪酶高产菌的研究正在不断深入^【4】。

2高产脂肪酶菌株

微生物作为脂肪酶的重要来源，目前已报道能够产脂肪酶的微生物大约有65个属，其中细菌28个属、放线菌４个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属。但实际上，脂肪酶在微生物界的分布远超过此，目前还不断发现报道新的产脂肪 酶的微生物。主要集中在假单胞菌属、有色杆菌属 、无色杆菌属、小球菌属、产碱杆菌属 、假丝酵母属、根霉菌属、曲霉菌属、青霉菌属、毛霉菌属多种细菌、酵母菌和霉菌^【5】。

表1 高产脂肪酶菌株

2.1洋葱伯克霍尔德菌

洋葱伯克霍尔德菌 (Burkholderia cepacia, BC) 为G-杆菌, 由美国微生物学家William Burkholder自腐坏洋葱中分离出来, 是一组基因型不同、表型相近的细菌群, 根据基因特征和表型特征至少可以将B.cepacia分为10个基因型, 称为洋葱伯克霍尔德菌复合型 (B.cepacia complex, 简称BCC).洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶 (B.cepacia lipase, BCL) 对多种有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等有较好抗性, 是目前在有机合成、洗涤剂添加剂和非水相催化中应用最为广泛的脂肪酶之一 。脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 是一类特殊的酯键水解酶, 能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应。作为重要的工业用酶, 脂肪酶在食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域应用十分广泛, 在生物能源 (生物柴油) 、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新型应用领域前景也十分广阔^[12] 。

2.2 克雷伯氏菌

克雷伯氏菌普遍存在于土壤、水体、谷物等自然环境以及生物体的消化、呼吸系统中。克雷伯氏菌属于革兰氏阴性菌, 根据近几年相关研究与报道, 其在污水处理及重金属治理方面具有很强的应用潜力^【13】。

3筛选方法

3.1洋葱伯克霍尔德菌

3.1.1筛选方法一：

罗丹明B（质量分数为１mg/mL）：0.1ｇ罗丹明B溶于100ｍＬ水中。

聚乙烯醇（质量分数为20ｍｇ／ｍＬ）：2ｇ聚乙烯醇溶于100ｍＬ 水中，加热溶解。脂肪乳化剂：聚乙烯醇和橄榄油以体积比３∶１混合，利用超声波进行乳化。

富集培养基：氯化钠，0.5 g/L；磷酸钠3.5 g/L；磷酸氢二钾1.5g/L；酵母膏，0.2 g/L；七水合硫酸镁0.5 g/L。

筛选培养基：磷酸氢二钾，0.5 g/L；磷酸二氢钾，0.5 g/L；氯化钠，10 g/L；胰蛋白胨，10 g/L；酵母膏，5 g/L；七水合硫酸镁，1 g/L； pH7.2~7.4；固体培养基加入琼脂，20 g/L；121 ℃灭菌20min。初筛培养基中加入罗丹明Ｂ，10mL/L；脂肪乳化液，12ｍL/L。 复筛培养基中加入橄榄油乳化液，12mL/L。

发酵培养基：胰蛋白胨，10g/L；酵母膏，5g/L；氯化钠，10 g/L；七水合硫酸镁，1 g/L；磷酸二氢钾，0.5 g/L；磷酸氢二钾，0.5 g/L；脂肪乳化液，12mL/L。

取１ｇ所采泥土样品，加入10ｍＬ0.9％的生理盐水中，200ｒ／ｍｉｎ的条件下充分振荡，静置后取１ｍＬ上清液于50ｍＬ富集培养基中，37℃、150ｒ／ｍｉｎ恒温振荡培养24ｈ，取１ｍＬ转入新的富集培养基中进行第二次富集，在同等条件下培养24ｈ后进行第三次富集，得到富集菌液。

取１ｍＬ所得富集菌液，梯度稀释至１０^－６倍浓度，菌液均匀涂布于初筛培养基，在37℃恒温培养３～４ｄ，在350ｎｍ处观察荧光圈，并用游标卡尺分别测量荧光圈直径和菌落直径的大小，以ＨＣ为指标，通过比较ＨＣ的大小进行筛选，其中ＨＣ＝荧光圈直径／菌落直径。

将所筛选得到的产脂肪酶菌株中ＨＣ较大的菌株进行发酵培养，37 ℃培养24h后，移取等体积且OD600＝0.8的菌液于复筛培养基平板上，重复３个平行，37 ℃培养，观 察透明圈，用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径的大小，取平均值，以HC为指标，通过比较HC的大小进行筛选，其中HC＝透明圈直径／菌落直径^【14】。

3.1.2筛选方法二：

富集培养基：硫酸铵,1.0 g/L，硝酸铵_,1.0 g/L，氯化钠1.0 g/L, 硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，大豆油1.0 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min；

初筛培养基：硫酸铵1.0 g/L，硝酸铵1.0 g/L，氯化钠1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，琼脂15.0g/L，橄榄油乳化剂 12.0g/L，1.6%溴甲酚紫1.0g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20min；

种子斜面培养基：硝酸铵2,0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂25.0g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；

发酵培养基：硫酸铵1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，蔗糖5.0g/L，脂肪乳化剂12.g/L，蛋白胨30.0g/L，pＨ7.0，121 ℃灭菌20min。

称取５ｇ不同地点采集的富含脂肪的样品溶于45ｍＬ无菌生理盐水中混匀，将2.5ｍＬ溶液接种于富集培养基，于30 ℃、180ｒ／min恒温摇床培养72ｈ。然后将长出菌落用蒸馏水梯度稀释成 10^－２，10^－３，10^－４，10^－５，10^－６，10^－７６个不同浓度，分别涂布于初筛培养基平板上，于30℃恒温培养72ｈ，挑取初筛培养基周围有黄色透明圈的菌落，接种于平板培养基上，30℃恒温培养72ｈ。待长出菌落并产生黄色变色圈后，挑取变色圈大的菌落进行复筛。因为脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸，使产脂肪酶菌株周围环境的pH由中性变为酸性，并出现黄色透明圈（溴甲酚紫在酸性条件下显示黄色），据此可将产脂肪酶菌株与其他菌株分离开来。

采用三丁酸甘油酯平板透明圈法^【15】测量变色圈的直径和菌落直径，如透明圈直径越大，说明产生的脂肪酶越多，菌落直径较小，说明该菌株产脂肪酶的能力越强。计算两者之比，选出比值较大的菌株纯化，然后进行摇瓶培养^【16】。

3.2克雷伯氏菌

3.2.1筛选方法一：

(1)富集培养基: 酵母膏 6.0 g/L, 橄榄油 10.0 mL/L,磷酸二氢钾 1.0 g/L, 磷酸氢二钠 2.0 g/L, 氯化钠0.5 g/L，七水合硫酸镁 1.0 g/L, pH 6.0。

(2)溶菌肉汤(lysis broth, LB)培养基: 牛肉膏 5 g/L, 蛋白胨 5 g/L, 酵母浸膏5g/L, NaCl 2 g/L, 葡萄糖 0.1 g/L, 乳酸钠 5 g/L, 溶于 1 L 水, pH 值自然; 固体培养基中加入2.5%的琼脂。

(3)平板初筛培养基: 橄榄油乳化液 120 mL硫酸铵2.0g/L, 磷酸二氢钾 1.0 g/L, 氯化钠0.5 g/L, 七水合硫酸镁 1.0 g/L, 琼脂 20.0 g/L, , pH 6.0。灭菌 20 min, 待冷却至60℃时, 按 50 mg/100 mL的量加入已灭菌的溴甲酚紫指示剂。

(4)三丁酸甘油酯培养基: 三丁酸甘油酯乳化液20.0 mL, LB 培养基 18.0 mL, pH 5.2, 乙酸-乙酸钠缓冲液 1000 mL, 琼脂20.0 g。

(5)发酵培养基: 橄榄油 10.0 mL, 酵母膏 20.0 g/L, 葡萄糖 10.0 g/L, 七水合硫酸镁1.0 g/L, K甲酚紫平板初筛培养基, 30℃条件下, 培养1~2 d,观察菌落形成及水解圈大小。形成水解圈的大小与菌落大小之比(D/d)越大, 说明该菌的产酶能力越强。将 D/d 值大的单个菌在平板上划线获得纯种, 然后转移在斜面上进行保藏。将三丁酸甘油酯培养基灭菌后, 按50 mg/100 mL的量, 加入灭菌后的溴甲酚紫指示剂, 无菌操作倒平板, 待平板凝固后, 在培养基上用打孔器进行打孔, 然后向每孔中加入10μL的菌液, 30 ℃条件下, 培养2~3 d,观察并测量形成的黄色透明圈的大小。挑选透明圈较大的单菌落, 进行摇瓶发酵培养, 培养条件为30℃ 磷酸 1.0 g/L, pH 6.0.

移取1 mL富集培养液, 于9 mL无菌水中, 充分振荡, 梯度稀释10⁵~10⁷倍,取70μL, 用涂布棒涂布于溴、160 r/min, 培养2 d后测定酶活。^【17】

3.2.2筛选方法二:

(1)富集培养基 (g/L) : 菜籽油2.5 g蛋白胨5.0 g, 酵母粉2.5 g, 葡萄糖10 g, , Tween-80 3.0 g, 加蒸馏水定容至500 m L, 121℃高温灭菌20 m

(2) 驯化培养基 (g/L) : 七水合硫酸镁0.25 g,磷酸氢二钾0.5 g, 磷酸二氢钾0.5 g,磷酸氢钠0.5 g,氯化钠，0.25 g,菜籽油2.5 g, p H自然, 加蒸馏水定容至500mL, 121℃高温灭菌20 min。

(3) 选择性平板培养基 (g/L) : 酵母粉0.25 g, 七水合硫酸镁0.1 g,硫酸铵0.25g, 磷酸氢二钾 0.15 g, 氯化钠0.25 g,琼脂10.0 g, 吐温-80 6.0 g, 菜籽油5.0 g, p H 7.0, 加蒸馏水定容至500 mL, 121℃高温灭菌20 min, 制备成平板。

(4) 发酵培养基 (g/L) : 菜籽油5.0 g, 七水合硫酸镁 0.25 g,硫酸铵1.0 g,磷酸氢二钾1.0 g, 磷酸二氢钠1.0 g, 氯化钠 1.0 g, pH 7.0, 加蒸馏水定容至500 mL, 121℃高温灭菌30 min, 备用。

(5) LB培养基: 无菌水100 m L, 酵母粉0.5 g,蛋白胨1.0 g, 氯化钠1.0 g, 121℃高温灭菌30 min, 备用

采集获得的含油脂废水, 加入适量无菌水, 震荡摇匀, 3层纱布过滤收集, 备用。 取25 m L过滤样品, 接种于含150 m L富集培养基的三角瓶中, 置于30℃, 150 r/min恒温摇床培养72 h。取25 m L富集培养后的菌液, 接种于含150 m L含菜籽油5.0 g/L驯化培养基的三角瓶中, 置于37℃, 150 r/min的恒温摇床上培养。4天为1个周期, 驯化培养28天, 每个周期结束后将驯化菌液接种至含油量递加5.0 g/L的驯化培养基中进行培养。主要采用吐温-80筛选法:取1 m L驯化培养后的菌液, 加入9 m L灭菌蒸馏水中, 混匀;随后吸取0.1 m L涂布于选择性平板培养基 (含吐温-80) 上, 置于37℃培养72 h, 观察菌落的生长情况及降解圈的大小。从初筛的选择性平板基中选取抑菌圈直径与菌落比较大的菌株进行多次重复划线分离, 置于37℃培养72 h直至得到纯菌株。挑取纯化的菌株至LB液体培养基中, 置于37℃, 150 r/min摇床中至摇匀浑浊, 存于4℃备用。^[18]

4菌种的鉴定及酶活测定

4.1酶活测定

罗丹明平板测酶活法：罗丹明 B 能与脂肪酶水解的各种可能的底物（单、二油酸甘油酯，油酸，油酸钠）结合为聚合体，该聚合体受紫外光激活，产生橘黄色荧光^［19］。依据有无橘黄色、颜色深浅和水解圈大小来判断是否产脂肪酶和对所产脂肪酶活力大小进行初步判断。

橄榄油乳化测酶活法：因pH对应关系 用橄榄油乳化法测定不同 pH 值的脂肪酶活力。采用橄榄油乳化法测定脂肪酶活力，pH 有较大影响，且不同脂肪酶的最适 pH 不同。^【20】

4.2菌种鉴定

观察所筛选出的菌株的菌落形态特征，颜色，透明度，有无气味等特征。采用革兰式染色法鉴别基本特征。根据《常见与常用真菌》鉴定手册进行鉴别

5. 课题研究的目的及意义

目前国内外用于获得脂肪酶的方法主要是微生物发酵法，然而选用的产脂肪酶微生物品种层次不齐，适合工业化生产的高产脂肪酶微生物菌种极度缺乏，且微生物脂肪酶的产量会受到菌株自身因素以及外界发酵条件的影响，如碳源、氮源、诱导剂、金属离子及培养条件等。因此，寻找新的更具有应用价值的脂肪酶菌株很有必要。本研究拟从自然界中筛选脂肪酶的生产菌株，通过酶活测定筛选出高产的脂肪酶菌株，并比较不同筛选方法对筛选结果的影响，为脂肪酶的工业化应用奠定基础。

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