文 献 综 述

1.蛋白酶的简介

蛋白酶（protelytic enzymes，EC 3.4）是催化肽键水解的一类酶，在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用^[1]。此酶种类繁多，广泛存在于所有生物体内，按所产蛋白酶性能分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶^[2]。在工业用酶当中,蛋白酶是应用最广的一种,约占整个酶制剂产量60%以上,广泛应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域。1945 年瑞士的Dr.Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶^[3],使蛋白酶有可能广泛用于洗涤剂工业。碱性蛋白酶主要用于加酶洗衣粉,可以减少含磷化合物用量,减轻环境污染^[4]。食品生产用蛋白酶分为动物、植物及微生物蛋白酶,其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点^[5]，因此，微生物蛋白酶的研究一直备受关注。

2.蛋白酶的一些应用

在高盐稀态酱油的发酵过程中，蛋白酶是最为重要的酶之一，负责原料的降解和氨

基态氮的生成，直接决定了酱油的品质。角蛋白酶有助于伤口结痂和上皮再生, 也可用于羽毛降解、皮革脱毛及一些洗涤用品及化妆品(如脱毛膏)等。木瓜蛋白酶因其稳定性好，蛋白水解能力强，并且对多种蛋白质均具有较好的降解作用 目前已被广泛地应用于诸多行业 在食品行业中 用于肉类嫩化 啤酒澄清 饲料添加剂和鱼类加工在工业行业中，用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等。在医疗卫生行业中，用于驱肠虫剂，治疗消化不良、各种炎症以及水肿等疾病。菠萝蛋白酶是一种植物蛋白酶，能够将饲料中的蛋白质转化成易于动物吸收的多肽和小肽，提高饲料的转化率，从而减轻养殖对环境的污染。菠萝蛋白酶对致病菌引起的腹泻也有一定的治疗效果，避免抗生素带来的负面影响，改善动物的生长性能，抵御寄生虫对动物的伤害；并且生产菠萝蛋白酶的资源丰富，具有大力开发和利用的潜能，是一种理想的抗生素替代型饲料添加剂。

3.蛋白酶高产菌株

大部分商业中性和碱性蛋白酶都来源于细菌，目前，已报道产胞外蛋白酶的细菌种类很多^[6]，常见的有芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Aeruginosa）等。商业化的产生蛋白酶的细菌源菌株来源较窄，筛选产蛋白酶的新菌株也成为目前蛋白酶制剂研究的热点之一，如Shankar等^[7]报道一株新的Beauveria sp.菌产生一种碱性蛋白酶，Haddar等^[8]通过对B.mojavensis A21 菌的发酵发现其产生两种新的碱性蛋白酶。

表一 高产蛋白酶菌株

3.1粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，主要存在于沿海盐碱土壤中，能够产生红色非扩散性色素。据报道，粘质沙雷氏菌所产的碱性蛋白酶不仅可以有效消除芽孢菌酶制剂的弊端，而且还具有一定的抗肿瘤活性^[15]。赵海霞等从土壤中筛选出一株产胶原蛋白酶的粘质沙雷氏菌^[16],天然酶活为21.19 U/mL，具有 较强消化牛皮的能力。WAN M等^[17]从二甲基亚砜中分离出一株产耐有机试剂蛋白酶的菌株粘质沙雷氏菌MH6，该菌在一定浓度的亲水有机溶剂中仍可保持稳定活性。

3.2枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、需氧杆状细菌，属于GRAS级益生菌，其在自然界分布广泛，研究人员已从土壤、海洋、植物体表、动物阴道与消化道、人体口腔及消化道等生境中分离，甚至在石油中也有发现。枯草芽孢杆菌自身可合成蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶类，具有很强的发酵能力，近年来常被用于发酵食品工业副产物以提高其利用价值^[17]。

4蛋白酶高产菌株的筛选

4.1粘质沙雷氏菌的筛选

4.1.1 筛选方法一^[18]

培养基:菌种筛选固体培养基：脱脂乳粉2.0%，琼脂2.0%。种子培养基：酵母提取物0.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，NaCl0.5%，磷酸氢二钾0.7%，磷酸二氢钾0.3%。

菌种发酵液体培养基：酵母提取物0.5%，蛋白胨1.0%,葡萄糖2.0%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.7%，磷酸二氢钾0.3%。培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌121℃、20min

菌株的初筛 取0.1g土样溶于1mL无菌水中，稀释10倍后取200μL混合液涂布于菌种筛选固体培养基上，于37℃静置培养2d。

菌株的复筛 挑取呈现透明圈的菌株于菌种筛选固体培养基上37℃静置培养2d。经分离纯化后挑取单菌落接入菌种发酵液体培养基中，于200r/min、37℃振荡条件下培养2d。发酵液经离心后取上清液测定蛋白酶活力。

4.1.2筛选方法二^[19]

筛选培养基（牛奶平板）：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，脱脂乳粉15.0g，琼脂15~20g,无菌水1000mL，pH7.0~7.4，脱脂乳粉溶解后单独灭菌（0.06MPa，30min），然后加至熔化的牛肉膏蛋白胨培养基中，混匀倒平板。

基础发酵培养基：葡萄糖40.0 g，蛋白胨20.0 g，Na₂HPO₄1.4 g，CaCl₂0.6g，MgSO₄ 0.4g，pH7.0~7.4。

产蛋白酶菌株的分离纯化：向收集的污水和土壤等样品中加入少量冷却后的无菌水，25℃、160r/min震荡30min后，按10倍梯度稀释，吸取稀释的菌悬液300μL涂布于牛奶平板上，37℃培养30h左右，观察平板长出的菌落，测量菌落周围的透明水解圈直径。 据菌落直径与水解圈比值的大小,确定分离的菌株，然后划线分离，直至获得菌株的纯培养。

菌株的液体培养复筛:将纯化的菌株接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、250r/min 振荡培养24h后，离心弃菌体，收集上清液，测定蛋白酶的活性。酶活的测定根据中华人民共和国专业标准：蛋白酶活力测定法（SB/T10317-1999）进行测定。酶活定义：40℃每分钟水解酪蛋白产生 1μg 酪氨酸为1个蛋白酶活力单位。

4.2枯草芽孢杆菌的筛选

4.2.1 方法一^[20]

初筛培养基（干酪素培养基）：干酪素30 g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂 20g，蒸馏水1000 mL，pH值自然。发酵培养基：豆粕粉40g，Na₂HPO₄ 8.4g，KH₂PO₄ 0.32g，CaCl₂ 1.7g，蒸馏水 1000mL，pH值6.0。

样品采集：除去地表浮土，然后挖 2~5 cm深的土壤样品，样品约取150g，装入灭菌后的塑料袋内。4℃冰箱中保存。

菌株初筛 ：配制NA培养基，121℃热压灭菌15~20 min。取样品10g置于已加入90mL无菌水的三角瓶中，220 r/min旋转摇床振摇，20min后静置5min。梯度稀释至质量浓度为10-8g/L，分别在10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 梯度下各取1mL样品稀释液涂布于酪蛋白培养基表面，将培养皿放入37℃培养箱中培养24h。取出平皿，选择生长良好、有明显水解圈的单菌落。

菌株复筛：配制发酵培养基，121℃热压灭菌15~20min。分别装入250mL的三角瓶中，装量为100 mL。分别点接入初筛得到的具有较大水解圈的菌株，37℃条件下220r/min旋转摇床培养48h。发酵液经5000r/min离心5min，得到上清液。用0.5cm直径打孔器在已灭菌的酪蛋白平板上均匀打孔，取上清液75μL加入孔中，于37℃恒温培养24h，根据水解圈和菌落直径的比值（R/r），筛选出能产生较大水解圈的菌株。

4.2.2方法二^[21]

富集培养基：蛋白胨5g/L、酵母膏1g/L、磷酸高铁0.1g/L、琼脂20g/L、无菌海水配制，调ph至7.6

脱脂乳粉平板：在TS（50mmol/LTRIS-HCL、150mmol/LNACL,ph8.0）中加入1%琼脂糖和1%脱脂乳粉，0.06Mpa高压灭菌10min，待温度稍冷后倾注平板。

种子培养基：蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化钠5g/L 调ph至7.5。

发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，调ph至7.5。

菌株的处理与富集：取1g土壤置于5ml无菌生理盐水中振荡30min，静置，取上清接种至富集培养基中

产蛋白酶菌株的初步筛选:分别取适量富集菌液接种于脱脂乳粉平板上，于35℃培养48h后观察。如果培养的细菌产生蛋白酶，则会在菌落周围产生透明的水解圈，根据水解圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值大小(D/d)判断菌株产蛋白酶能力的强弱，并挑取产蛋白酶能力强的菌落进行复筛。

产蛋白酶菌株的复筛:取初筛后的菌株接种种子培养基，170r/min、35℃振荡培养24h。再将菌种液以体积分数1%接种于发酵培养基，170r/min、35℃振荡培养48h，然后12000r/min离心20min，收集上清液，采用改良Lowry法（福林－酚法）检测蛋白酶活力，一定条件下每1min水解 酪蛋白产生１μｇ酪氨酸定义为１个酶活性单位(U/ml)

5.课题研究的目的和意义

采用发酵工程技术生产蛋白酶,原料便宜,不受土地和季节的限制,是生产蛋白酶的优良方法。用于食品加工的蛋白酶可以由多种微生物生产,然而当前国内外主要对真菌产生蛋白酶进行了大量的研究,而对细菌发酵生产蛋白酶研究的较少。本研究拟从自然界中筛选出蛋白酶的高产菌株，比较不同筛选方法对筛选结果的影响，对筛选出的菌株进行分析鉴定，测定最适温度及ph，确定产生蛋白酶的最大酶活。

通过这次研究，熟悉菌株筛选过程，了解发酵工程的上游工程的基本操作，为以后的工作研究奠定基础。

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