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摘 要

现今由于水产品品种丰富、市场需求大，不同品种之间的存在近缘关系使价格有着较大的差距，水产品掺假现象扰乱市场秩序且损害消费者的利益。本次实验建立的是可同时鉴别狭鳕和大西洋鳕鱼的双重实时荧光 PCR 法方法。此次使用的方法是基于目前已有的单一物种源性成分检测方法, 使用多重实时荧光PCR技术对大西洋鳕鱼和狭鳕同时进行检测, 并对PCR引物浓度进行优化。同时通过双重PCR体系可一次反应同时扩增出大西洋鳕鱼和狭鳕条带，电泳条带清晰。结果表明：建立的大西洋鳕鱼和狭鳕动物源性双重PCR测定方法具有良好的灵敏度和特异性，该方法效果良好、缩短了时间、降低了成本, 能给相关监管部门解决水产品市场监管问题提供借鉴。

关键词：大西洋鳕鱼 狭鳕 双重实时荧光PCR

Simultaneous identification of Gadus morhua and Theragra chalcogramma by dual real-time PCR

Abstract

Nowadays due to the rich variety of aquatic products and the large market demand, the close relationship between different varieties makes the price gap wide, however, the adulteration of aquatic products disrupts the market order and harms the interests of consumers. This experiment establishes a method for the simultaneous identification of Theragra chalcogramma and Gadus morhua by dual real-time PCR. The method used this time is based on the existing single species source component detection method, using multiple real-time PCR technology to simultaneously detect Gadus morhua and Theragra chalcogramma, and optimize the PCR primer concentration. At the same time, clear Gadus morhua and Theragra chalcogramma bands were amplified simultaneously by duplex PCR. The results showed that the established duplex PCR method for the determination of Gadus morhua and Theragra chalcogramma had good specificity and sensitivity. The method has good effects, shortens time and reduces costs, and can provide reference for relevant regulatory authorities to solve the problem of aquatic product market supervision .

Key words: Gadus morhua; Theragra chalcogramma; dual real-time PCR

目录

摘要 I

Abstract II

1.大西洋鳕鱼和狭鳕 1

1.2 基于DNA检测方法 2

1.2.1 DNA条形码 3

1.2.2 实时荧光PCR 4

1.2.3 多重PCR 4

1.3 本研究目的和意义 5

第二章 材料与方法 6

2.1 材料 6

2.1.1 样品采集 6

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 实验仪器 7

2.2实验方法 7

2.2.1 DNA提取 7

2.2.2 引物设计 8

2.2.3 单重PCR反应体系优化 8

2.2.4 双重PCR 反应体系优化 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 大西洋鳕和狭鳕引物浓度优化 10

3.2大西洋鳕和狭鳕Mix浓度优化 10

3.3 双重PCR引物浓度优化 11

第四章 结论与展望 13

参考文献 14

第五章 致谢 16

第一章 文献综述

1.大西洋鳕鱼和狭鳕

伴随着人们对生活质量要求和人民经济水平不断提高，养殖、捕捞技术日益完善，各品类的水产品也开始更多的出现在餐桌上。全球人均水产品消费量预计从2010~2012年的18.9 kg将增长到2022年的20.7 kg，到2050年，水产品基本需求量将是现在的1.5倍^[1]。作为渔业大国，中国占有世界水产品生产总量的1/3之多，2016年中国的水产品总消费量就有6813万吨^[2]。

同时水产品掺假现象频频发生在我们日常生活中，这种行为可能不是故意造成的，因为不同鱼的品种在不同地域内有不同的叫法，而不同的鱼品种之间存在近亲关系，造成界限模糊的机率较大。然而，一些唯利是图的商贩利用某些鱼类产品在外形、口味和质地方面的相似性，用商业价值较低的品种来取代具有较高商业价值的品种，来谋取非法利润。消费者如果在不知情或者无法判别的情况下，就可能会受欺骗，以较高的价格买到不符其高价格的假劣食品。这种行为不仅扰乱了良性健康的市场秩序，更极大地损害了消费者的合法利益，甚至危害消费者的生命健康。随着人们重视程度的提高，围绕鱼类产品掺假的研究也在不断跟进，多种已开发的PCR检测技术得到广泛应用。如今像英国的TepnelBiosystems公司已经开发出了鱼类物种检测的试剂盒，可以完成鱼类物种的定性鉴定，如研制出可以将鳟鱼、鳕鱼等鱼类的DNA样品经过磁珠纯化和PCR扩增及凝胶电泳定性检测的试剂盒^[3]。

鳕鱼是一大类鳕形目鱼类的统称，是常见的可食用鱼类之一，具有极高的经济价值，捕捞量大。据报道，2017年全球鳕鱼捕捞量为943.32万吨，占海洋渔业总产量的13.57%，其中，鳕科（Gadidae）是海洋渔业的主要捕捞对象之一。狭鳕（Theragra chalcogramma，Theragra，Gadidae）和大西洋鳕（Gadus morhua，Gadus，Gadidae）分列2016年全球捕捞产量排行榜第一和第九。

大西洋鳕鱼原产地在美国东部的北大西洋及北欧至加拿大的部分寒冷水域^[6]，它商业价值高、口感厚实鲜美、营养丰富，其主要出口国主要是冰岛、挪威等北欧国家、还有加拿大及俄罗斯，且我国对于鳕鱼的消费量呈现逐年上升趋势。

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