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摘 要

威兰胶（welan gum）是一种胞外多糖，它是由革兰氏阴性菌鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）好氧发酵生产的。该多糖十分易溶于水，它的水溶液具有良好的流变学性质以及理想的耐高温、耐酸碱性。广泛应用于在水泥、石油、油墨、食品这些行业中，威兰胶作为悬浮剂、增稠剂、稳定剂被经常使用，同时，也受到其他行业的关注。但是发酵过程中，随着威兰胶的积累，发酵液粘度迅速增大，严重制约了氧传递效率，使得溶氧成为威兰胶生产效率提高的重要限制因素。

透明颤菌血红蛋白（vitreoscilla hemoglobin，VHb）是在20世纪70年代后期被发现出来的一种血红蛋白，在低氧情况下，透明颤菌在该蛋白帮助下得以生存并且它的生长速率也很理想，并且，在最近几年来，透明颤菌血红蛋白在生物工程领域被广泛的使用。本课题是利用基因工程技术而扩增出来透明颤菌血红蛋白基因（vgb）片段，并使它在威兰胶生产菌株中进行异源表达，用这一方法来提高菌体对低溶氧情况下的耐受性，从而达到威兰胶产量提高的目的。

关键词：威兰胶 透明颤菌血红蛋白 接合转移 发酵

Enhancement for welan gum production via heterologous expression of the Vitreoscilla hemoglobin gene

Abstract

Welan gum is an extracellular polysaccharide produced by aerobic fermentation of the gram-negative bacteria Sphingomonas sp. The polysaccharide is soluble in water, and the solution has unique rheological properties and good temperature, acid and alkali resistance. It can worked as suspending agents, thickening agents, stabilizers, etc. in cement, oil, ink, food and other industries, and it has got more and more attention for its wide uses. However, during the fermentation process, with the accumulation of welan gum, broth viscosity increases rapidly, which severely restricted the oxygen transfer efficiency. So the dissolved oxygen become an important limiting factor in the production efficiency of welan gum.

VHb is a hemoglobin found in late 1970s, and the protein enables Vitreoscilla survive and maintain a high growth rate under hypoxic conditions. In recent years, it's used more widely in biological engineering. In this study, we introduced vgb into welan production strain, Sphingomonas sp. CGMCC 2428, and under the control of T7 promoter, the VHb expression led to an increase of biomass and exopolysaccharide production.

Keywords: welan gum; vgb; conjugation transfer; fermentation

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1生物合成威兰胶的研究进展 1

1.1.1威兰胶的结构与性质 1

1.1.2 威兰胶的应用 2

1.1.3 威兰胶的发酵生产 3

1.2 透明颤菌血红蛋白的发现及应用 3

1.3 研究意义 4

第二章 重组菌株的构建 6

2.1 前言 6

2.2 材料与方法 6

2.2.1 实验试剂 6

2.2.3 菌株与质粒 8

2.2.4 培养基和培养条件 8

2.2.5 目的基因片段克隆与重组菌株的构建 8

2.2.6 重组菌株中VHb活性检测 13

2.3 结果与讨论 13

2.3.1 重组E.coli 阳性转化子的验证 13

2.3.2重组S. sp. - vgb转化子验证 14

2.3.3重组S. sp. - vgb中VHb的表达活性检测 15

2.4 本章小结 16

第三章 重组菌株发酵生产威兰胶的研究 17

3.1 前言 17

3.2 材料与方法 17

3.2.1实验仪器 17

3.2.2 菌种 17

3.2.3 培养基及培养条件 17

3.2.4 分析方法 18

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 VHb的异源表达对威兰胶摇瓶培养过程的影响 19

3.3.2 VHb的异源表达对威兰胶发酵罐培养过程的影响 19

3.4 本章小结 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致谢 25

第一章 前言

1.1生物合成威兰胶的研究进展

1.1.1威兰胶的结构与性质

威兰胶属于酸性微生物杂多糖，它最开始是被在海藻和植物中发现的。由于植物和海藻受环境因素影响很大，因此威兰胶多由革兰氏阴性菌Sphingomonas sp.发酵而成 ^[1,2]。威兰胶的基本结构和性质如下图1-1和表1-1所示。

图1-1 威兰胶结构式

表1-1 威兰胶理化性质

1.1.2 威兰胶的应用

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