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摘 要

蔗糖磷酸化酶在工业或者生活中有着广泛的应用，其特异性转化某些糖苷键修饰葡萄糖，在合成一些聚合度相对较低的糖原或者对于某些醇羟基和酚羟基的特异修饰合成某些不稳定物质的衍生物中有着广泛的应用，但蔗糖磷酸化酶的产量较低，未能满足市场上的需求。

本研究通过分子生物学的手段，把带有NusA融合标签的pET50b-HNusA-TSPase质粒与未带有NusA标签的pRSF-TSPase质粒转化至E. coli BL21(DE3)，构建重组菌株并诱导蔗糖磷酸化酶的表达，以提高酶在异源条件下的高效可溶性表达，并用金属亲和层析法，采用Ni柱亲和层析法进行重组TSPase 的纯化并进行分梯度洗脱、纯化。研究结果表明：带有pET50b-HNusA-TSPase质粒的菌体，虽然TSPase酶产量大大提高，但是无法得到纯酶。由此可见，带有NusA融合标签的质粒对于菌体本身蛋白质酶类的折叠和表达具有较强的提高，但是影响酶的纯化。

关键词：蔗糖磷酸化酶 NusA标签 纯化

Heterologous expression and purification of sucrose phosphorylase

Abstract

Sucrose phosphorylase catalyzes the transfer of glucoside bond and we named it as a specific enzyme. It is widely used in the synthesis of oligosaccharides, modified alcohol hydroxyl, phenol hydroxyl compounds and the synthesis of derivatives of some unstable substances. However, the output of sucrose phosphorylase is not adequate, which can not meet the market demand.

This study uses molecular biology method ,transformed a plasmid called pET50b-HNusA-TSPase which contained NusA tag  and a plasmid called pRSF-TSPase which does not carry a NusA tag in to E. coli BL21(DE3) ,structured a recombinant plasmid and induced it to express sucrose phosphorylase ,to improves the highly soluble expression of this enzymes in heterogeneous conditions. At the same time, using Ni column affinity chromatography to do some gradient elution and purification of recombinant TSPase. For my own research of the facts shows that although the production of TSPase was greatly increased, the pure enzyme could not be obtained. Thus it can be seen that the plasmid with NusA fusion tag has a strong improvement on the folding and expression of protein enzymes, but it also affects the purification of the enzyme.

Key Words: Sucrose phosphorylase; NusA tag; purification

目录

摘 要……… I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 蔗糖磷酸化酶 1

1.1.1 蔗糖磷酸化酶的性质与结构 1

1.1.2 蔗糖磷酸化酶的应用 1

1.1.3 蔗糖磷酸化酶的异源表达 2

1.2 酶的表达系统构 2

1.2.1 融合标签的使用 2

1.2.2 His-tag标签的使用 4

1.3 酶的分离纯化 5

1.4 研究内容和研究意义 5

1.4.1研究内容 5

1.4.2 研究意义 6

第二章 蔗糖磷酸化酶的表达与纯化 7

2.1 前言 7

2.2 实验材料 7

2.2.1 实验仪器 7

2.2.2 实验试剂 8

2.2.3 质粒及菌株 9

2.2.4 工具酶与试剂盒 10

2.2.5 培养基及纯化流动相 11

2.3 实验方法 11

2.3.1 重组质粒的提取与转化 11

2.3.2 重组蔗糖磷酸化酶的诱导表达 13

2.3.3 粗酶液的制备 13

2.3.4 粗酶液的分离纯化 13

2.3.5 蛋白浓度的测定 14

2.3.6 SDS-PAGE电泳分析 14

2.4 结果与讨论 14

2.4.1 重组质粒验证 14

2.4.2 重组蔗糖磷酸化酶的异源表达 15

2.4.3 重组蔗糖磷酸化酶的分离纯化 16

第三章 结论与展望 19

3.1 结论 19

3.2 展望及下一步工作建议 19

参考文献 21

致谢 25

文献综述

1.1 蔗糖磷酸化酶

1.1.1 蔗糖磷酸化酶的性质与结构

蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase, SPase, EC2.4.1.7)可逆地催化蔗糖磷酸化,生成α-D葡萄糖-1-磷酸酯(G-l-P)和D-果糖。该酶是一种葡糖基转移酶, 能转移蔗糖葡糖基和G-l-P以及包括D-果糖在内的一些糖^[1-4]。

蔗糖磷酸化酶属于GH13家族，是一种催化转移葡萄糖基的特异性酶^[5]。主要催化反应类型有两种：(1)将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至相应受体；(2)将蔗糖水解并可转移葡萄糖基至相应受体，受体可以为水、无机磷酸、含酚羟基和醇羟基等物质^[6]。若以葡萄糖为受体，可生成麦芽糖和曲二糖。

不同来源SPase有其独特的结构和底物特异性，由2004年解析出青春双歧杆菌来源的SPase的晶体结构，结果表明其为同型二聚体，并拥有4个结构域,分别是A域、B域、B＇域和C域，其活性中心位于A结构域的P4和35的末端，包含残基Aspl92(葡萄糖异头碳结合位点)和Glu232(葡萄糖苷结合位点) ^[7]。

1.1.2 蔗糖磷酸化酶的应用

1.蔗糖磷酸化酶主要用于催化产生不稳定物质，及衍生物的的相继产生。采用蔗糖磷酸化酶可以产2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸（Ascorbicacid 2-glucoside, AA-2G）。该物质是维生素VC的一种，该反应中，糖基转移酶把供体上的葡萄糖苷转移到VC的C2上，使得衍生物的水溶性，稳定性大大提高^[8]。其次，在低聚糖的合成中，磷酸化酶是常见的角色之一。淀粉、蔗糖、乳糖等都是该酶的合成原料，可见该酶的合成原料范围之广。2.再生资源的利用是当今的热点之一。如原料为淀粉的时，形成的麦芽低聚糖浆是由经过α和β两种形式的淀粉酶的作用而产生，其次，为了特定合成某种特定的空间结构形式，利用各种多样的葡萄糖苷基团酶蔗糖，合成相关的化合物。磷酸化酶作为磷酸化酶的一种^[9]，具有广泛的底物特异性。

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