摘 要

近年来，一些不法商家利用劣质蛋白质或者化学合成物充当优质鱿鱼进行贩卖。对于食品安全鉴定，基于头足类物种线粒体的COI基因的荧光PCR生物鉴定已经成为了主要研究方法。本文首先对市场采样物种进行了生物测序，之后对设计的特异性引物验证和退火温度进行优化，研究了茎柔鱼（Dosidicus gigas）的DNA特异性差异。

结果表明，对市场上购买的鱿鱼DNA提取成功，物种测序结果成功。对于设计的三种特异性引物中，DosgF-2和DosgR-2特异性最为优秀，在64℃下针对茎柔鱼这一物种特异性最明显。结果最终验证了利用荧光PCR对头足类物种掺假鉴定的可行性。

本课题的研究可为我国食品监管部门提供良好的食品安全检测的方法，起到规范我国海鲜产品市场和保护消费者利益的作用。

关键词：荧光PCR、COI基因、头足类物种、物种掺假

Application of fluorescent PCR in adulteration identification of cephalopod species

Abstract

In recent years, some illegal businesses use inferior proteins or chemical compounds to act as high-quality squid for trafficking. For food safety identification, fluorescent PCR biological identification based on the mitochondrial COI gene of cephalopod species has become the main research method.In this paper, the biological sequencing of the sampled species in the market was carried out, and then the designed specific primers were verified and the annealing temperature was optimized to study the difference of DNA specificity of Dosidicus gigas.

The results showed that the DNA of squid purchased on the market was extracted successfully and the result of species sequencing was successful.Among the three specific primers designed, the specificity of DosgF-2 and DosgR-2 was the best, and the specificity for the species of soft fish was the most obvious at 64 ℃.Results the feasibility of using fluorescent PCR to identify cephalopod species was verified.

The research of this topic can provide good food safety testing methods for food regulatory departments in China, and play a role in standardizing the market of seafood products and protecting the interests of consumers.

Keywords: fluorescent PCR COI gene cephalopod species species adulteration

目 录

摘要 I

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1茎柔鱼（Dosidicus gigas）的介绍 1

1.2 茎柔鱼类的品种掺假现象 1

1.3基于DNA的检测方法 2

1.3.1 DNA检测方法的优势 2

1.3.2常见的DNA检测方法 2

1.4 SYBR GREEN I荧光PCR 3

1.4.1荧光PCR的原理 4

1.4.2荧光PCR的分类 4

1.4.3 SYBR GREEN 荧光PCR 4

1.5 实验目的 5

第二章 材料与方法 6

2.1 样品采集 6

2.2 主要仪器 8

2.3 主要试剂 8

2.4 实验方法 9

2.4.1 DNA的提取 9

2.4.2 DNA浓度和纯度测定 9

2.4.3 引物设计及优化 9

2.4.4 PCR扩增 10

2.4.5 特异性 11

第三章 实验结果与讨论 13

3.1 普通PCR扩增以及物种测序 13

3.2 引物设计验证结果 14

3.3 退火温度的优化 14

3.4 特异性验证结果 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

1.1茎柔鱼（Dosidicus gigas）的介绍

头足类物种。通常是我们常见的的软体动物类的种的头足纲科目，具统计现存约650种，如章鱼、乌贼、鹦鹉螺、枪乌贼等。从近海岸到远海，表层到4500公尺以下深处均有分布。然而在盐度较低的淡水水域中较为罕见。这些头足类物种也分布于我国周边海域，具有数量巨大，食用以及市场经济价值较高，制作加工成本低，容易出产等特点。也因为其特点，头足类物种在食品行业也具有巨大的市场和更广阔的开发潜力。

茎柔鱼（Dosidicus gigas），头足类物种之一。也叫“洪堡鱿鱼”或者“美洲大赤鱿”，是大洋型经济头足类，资源丰富；容易的捕捞方式；产能高；且利用价值高。根据数据统计得知，这种头足类物种主要捕捞作业渔场分布于加利福尼亚湾、哥斯达黎加海岸、秘鲁沿岸区域和外海部分区域、智利沿岸和赤道海域等。因为其大量活跃于秘鲁沿海附近，也被称为秘鲁茎柔鱼。根据FAO统计，2014年中国茎柔鱼产量为33.3万吨，为历史最高产量，之后2015年中国茎柔鱼产量为32.4万吨^[16]。

1.2 茎柔鱼类的品种掺假现象

食品掺假。我们理解的食品掺假就是向食品中加入非食品原料，或者以次充好再者就是用相近的化学合成的物品充当动植物组织，如在鱿鱼干制品中加入非鱿鱼组织提高其蛋白质含量，严重者会危及到消费者的生命安全。

头足类掺假。头足类鱿鱼粉是人体吸收优质海洋蛋白质的普遍途径，由于其价格高，利润高的原因，市场上的鱿鱼粉会出现大量掺假现象。有些不法商家会将蟹壳粉、虾壳粉、贝壳粉等磨制成蛋白粉混入鱿鱼粉中。还有利用化学类物质合成充当鱿鱼制品，其成分不含任何蛋白质。在掺假物中，经过权威机构检验，其中含有大量对人体无益的粗蛋白物质，没有人体必需的八大氨基酸。而这些粗蛋白也很难被人体消化吸收，长久使用会对人体产生不可逆的损伤。其中水解羽毛粉的粗蛋白含量高达80%以上，但其中的色氨酸、组氨酸等极度缺乏，对人体毫无益处，没有利用价值^[19]。