文 献 综 述

引言

丁二酸（琥珀酸）是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中^［1，2］ 。琥珀酸作为TCA循环的中间产物之一，在生物的代谢中占有非常重要的地位，因此被广泛应用于合成化学药物的中间体。琥珀酸还是一种具有特殊鲜味的物质，可以应用于食品工业以满足某些食品的特殊需要。

丁二酸作为一种四碳酸是优秀的化学平台产品，具有二元酸大多数的典型反应，由于丁二酸分子含有两个活泼的亚甲基，因此又具有许多别的重要反应特性，如卤化、脱水、酯化、磺化、酰化、氧化、还原等。丁二酸具有优良的性质，所以可合成多种复杂有机物的中间体和制造药物，广泛用于合成塑料、橡胶、医药、食品、涂料等工业中^[3]。近年来, 由于不断升拓新的应用领域, 国际市场上需求猛增, 呈现出诱人的发展前景。传统的丁二酸发酵是基于甘蔗中的蔗糖或玉米和谷物的淀粉水解物中的葡萄糖，但丁二酸的生产要求原料成本较低且应不与食物来源相冲突，如何利用廉价生物质等可再生资源进行丁二酸生产也已成为各国的研究热点之一^[4-7]。

植物光合作用的生物量要由纤维素、半纤维素和木质素构成，分别占干重的45%、30%和25%左右(Brigham et al 1996)。从总量上看,纤维素、半纤维素和木质素是世界上最广泛的可再生性生物资源。木质纤维素广泛存在于林业及农业废弃物中,木质纤维素的水解产物为五碳糖(D-木糖和 L-阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)，其中六碳糖约占 2/3,五碳糖约占 1/3。而在半纤维素的水解产物中，D-木糖约占 90%^[8]。充分利用纤维素原料中的木糖发酵生产丁二酸，能使纤维素原料的丁二酸发酵的产量在原有的基础上有所增加。因此，如何高效利用木糖是利用植物纤维资源生产丁二酸的关键因素。

大肠杆菌, 是兼性厌氧型微生物, 厌氧混合酸发酵过程中通过TCA还原支路产生少量琥珀酸^[9] 。大肠杆菌是生产工业产物的常用宿主菌，由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养及利用碳源广等诸多优点，被认为是最有潜力的琥珀酸生产菌株^[10]。许多代谢工程策略已经用于提高大肠杆菌琥珀酸的产量^{[ 11-13]}。另外, 大肠杆菌厌氧发酵生产琥珀酸需要固定CO2, 能够利用温室气体主要成分CO2, 因而厌氧发酵琥珀酸在保护环境方面具有不可替代的重要作用。然而，厌氧发酵过程存在着菌体量小、碳源利用缓慢、产物合成速率低等缺点^[14,15]。因而，随着生物技术的发展，利用遗传工程的手段改造大肠杆菌，扩大其底物利用率是目前研究的重点。

1.1 大肠杆菌的木糖代谢

大肠杆菌D-木糖利用有关酶及其结构的最早研究报道见于上世纪七十年代初期。在野生型大肠杆菌X289菌株中，受D-木糖诱导后三个木糖代谢酶活性出现的先后顺序依次为异构酶、激酶、透性酶，并且三个基因受同一个因子调控^[16]。七、八十年代，人们认为在肠道细菌中木糖利用基因至少包括四个基因，即木糖透性酶基因、木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和调节基因。八十年代，人们开始克隆大肠杆菌D-木糖利用有关基因，并研究其结构与调控机制。Maleszka等构建了带有大肠杆菌基因片段的CoIE1重组质粒，该质粒上含有木糖操纵子中的三个基因，即木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和调节基因，转入该质粒的大肠杆菌和Salmonella typhimurium木糖缺陷型菌株均能在木糖上生长，证实大肠杆菌中的确存在木糖操纵子^[17]。1983 年通过与木糖异构酶缺陷型菌株互补克隆得到长1320bp 编码440个氨基酸残基木糖异构酶基因（xylA）^[18]。1984 年 Rosenfeld 等人通过实验证明了大肠杆菌的xylA 和 xylB 基因组成了操纵子，该操纵子在一个受木糖诱导的启动子下进行转录。他们的研究结果还表明 xy1B 基因可能还有一个不受木糖调节的自身的弱启动子。

1980年Veronica等首次报道在E. coli K12中由H 浓度梯度驱动的木糖转运系统，并推测大肠杆菌中可能有两种木糖转运系统存在^[19]。Elaine等的研究则进一步明确了这两种转运系统的存在，将与H 相关的转运系统的基因称作xylE，并定位于E. coli K12 连锁图的91.4min 处^[20]。1987年Elaine等克隆了xylE 并测定了其序列，而在1993年发表的大肠杆菌K12 MG1655基因组89.2 至92.8分钟的序列分析中已标明了xylE基因^[21]。1994 年发表的大肠杆菌 K12 MG1655 基因组76.0 至81.5 分钟的序列分析中，与木糖利用有关的其它基因全部定位，按序列编号顺序依次为 xy1B （木酮糖激酶基因）、xylA（木糖异构酶基因）、xylF（木糖结合蛋白基因）、xy1G（ATP 结合蛋白基因）、xy lH（木糖透性酶或木糖转运蛋白基因）和xylR（调节蛋白基因)^[22]。

1997年Song等报道了E. coli K12 菌 D-木糖操纵子的基因组构与调控的研究结果（图 1)。其中 PA的起始位点在 xylA 的-42 处，而 PF则分别在 xylFGH 的-60 和-62 处有两个起始位点，两个启动子的翻译均受木糖诱导和葡萄糖降解抑制。xy1R 在 xy1FGH 的下游，有自己的弱启动子，启动子位于 xy1R 的-10 和-35 之间，不受木糖和葡萄糖降解调控。xylR 基因产物正向调控 xylFGH与 xylAB 的转录和表达，xy1R 突变导致 PA、PF完全不能表达，菌株在 D-木糖基本培养基上不生长，其转运蛋白也受影响。xylF-和 xylB-不能在 D-木糖基本培养基上生长，但其转运 D-木糖的能力不受影响，与野生型菌株相当。xylF 和 xylG 突变菌株，其相应的蛋白表达受影响，酶活降低，但突变株在 D-木糖基本培养基上生长受到抑制。