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摘 要

本文以褶皱假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase）为实验对象，运用交联酶聚集体技术，以求可以制备活性较高、稳定性较强及可重复使用的固定化脂肪酶。将叔丁醇/乙腈（1:1,V:V）作为沉淀剂，把戊二醛和聚乙烯亚胺作为混合交联剂，制备交联酶聚集体。本实验将酶活回收率视作考察的主要指标，最适的工艺条件为：游离脂肪酶溶液的浓度为 20mg/m L，沉淀时间为 1 h，1%（V/V）戊二醛溶液和3 mg/mL 聚乙烯亚胺的添加量分别为 1 mL 和 1 m L，交联时间为 2h。在这些前提条件下生产得到的交联酶聚集体的酶活回收率达到23%。

关键词：脂肪酶 交联酶聚集体 沉淀 交联 酶活回收率

Cross-linked enzyme aggregates: application to Candida rugosa lipase

ABSTRACT

Cross-linked enzyme aggregates of Candida rugosa lipase are a promising method for enzyme immobilization with high activity recovery and high thermal stability. In this work, cross-linked enzyme aggregates were prepared using terbutanol /acetonitrile as precipitants and polyethyleneimine and glutaraldehyde as crosslinking reagents. The optimum conditions of the immobilization process were determined: enzyme concentration: 20 mg/mL, precipitation time for 1h, addition of 1%(V/V) glutaraldehyde and 3mg/mL polyethyleneimine are 1 mL and 1 mL respectively, cross-linking time for 2h, the cross-linked enzyme aggregates activity recovery reached to 23% under such conditions.

Key words：lipase; cross-linked enzyme aggregate; precipitant; crosslink; enzyme activity recovery

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1课题研究背景 1

1.2脂肪酶的概述 2

1.2.1 脂肪酶的性质 2

1.2.2 脂肪酶的作用机制 2

1.3酶的固定化 3

1.3.1 固定化酶的性质 3

1.3.2 载体固定化 3

1.3.3 无载体固定化 4

1.4交联酶聚集体 5

1.4.1 交联酶聚集体的性质 5

1.4.2 交联酶聚集体的制备 5

1.4.3 影响交联酶聚集体性质的因素 6

1.4.4 交联酶聚集体的应用 6

1.5本课题研究的目的和意义 7

第二章 材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.1.1实验试剂 8

2.1.2实验仪器 8

2.2实验方法 9

2.2.1交联酶聚集体的制备 9

2.2.2酶蛋白回收率测定方法 9

2.2.3游离脂肪酶和交联酶聚集体水解活性的测定方法 10

2.2.4 交联酶聚集体的重复利用能力 11

第三章 实验结果与讨论 13

3.1沉淀剂的种类对酶活的影响 13

3.2沉淀剂的浓度及沉淀时间对酶活的影响 14

3.3沉淀剂的用量对酶活回收率的影响 15

3.4 PEI及GA的浓度对酶活回收率的影响 16

3.5 PEI及GA的用量对酶活回收率的影响 17

3.6交联时间对酶活回收率的影响 17

3.7交联酶聚集体的重复利用能力 18

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望及进一步工作的建议 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1课题研究背景

由于酶在催化方面的高效性，使得其应用越来越广泛。在工业生产生活上，酶是一种重要工具，它可应用于一些具有立体选择、区域选择、化学选择性的反应^[1]。但是，人们在游离酶的应用过程中发现其有一些缺点，如酶的稳定性差，酶蛋白的高级结构在温度、酸、碱、无机离子等条件的干扰下易失活，很难自反应体系中分离开来,难以重复使用，生产成本高，不利于大规模使用^[2,3]等。在许多情况下，如生产一些精细化学用品、药品、调味品、食品添加剂和个人护理用品，需要酶在有机溶剂中处于相当长时间的稳定状态。为实现这一要求，我们可以将酶固定化，来促进酶的回收和再利用，进而提高经济效益。

固定化酶是一种在一定的空间领域内起催化作用，并且能重复使用和持续应用的酶。固定化是一种采用有关物理或者化学的方式，对可溶于水的酶进行加工制造，把它制成不能溶于水，但是仍然含有酶活力的固定化酶。固定化酶拥有很高的稳定性、容易分散、可回收应用、可循环利用。固定化酶又可归纳成2类，一类需要载体，另一类不需要载体。在使用载体固定化酶的同时，由于引入了许多的无催化活力物质，酶的催化效果和蛋白装载量下降。此外，把酶固定在载体上，尤其是在高载酶量的状况下，经常会引起酶高达50%的天然活力的消失^[2]。并且我们同时还缺乏经验和引导来将一个天然的载体制成含有特定的使用功能的载体。综上所述，我们需要消耗大量的劳力和物力，不断地进行实验，才可能获得理想的载体固定化酶^[4]。由于它的上述不足之处,导致了无载体固定化方法处于比较明显的上风。

近年来，无载体固定化酶已经引起越来越多研究者们的目光和关注，CLEAs方法是一类新型的无载体固定化方法，它具有许多突出的优点，如不需要载体的引入、制备工艺简便、酶回收率较高、花费少、稳定性强等，可以用来替代传统的载体固定化酶。现今，CLEAs的制成方法已经变成酶固定化范畴中的钻研热门^[5]。因此，研究CLEAs的制备意义十分重大。

1.2脂肪酶的概述

1.2.1 脂肪酶的性质

脂肪酶又被称作三酰甘油水解酶，它的主要功能和作用是将甘油三酯生物催化水解，最终得到甘油和脂肪酸。它可以在油-水界面上进行一系列有机合成反应，如酯解、醇解、酯交换、酯合成等^[6]。它是一类非常重要的酶催化剂，也是一种使用较多的工业用酶，普遍应用于食品工业、化学制品工业以及药物的合成等众多范畴。

脂肪酶具有如下特性：（1）催化活力高。（2）底物特异性广泛。（3）较强的位置选择性。（4）较好的同分异构体选择性。（4）热稳定性良好。（5）副反应少。（6）微生物来源丰富等。

1.2.2 脂肪酶的作用机制

通过一系列的探索，人们发现有本原差异的脂肪酶，它们的氨基酸的组成个数范围为270 ~ 641，它们的相对分子质量量大小范围为29000 ~ 100000。一直到现在，科学家们最终已经得到了合成脂肪酶活性中心的三元组结构，此过程所测得的酶的氨基酸组成、晶体构造等数据主要依赖于X-衍射和定向修饰等方法，此过程所用的各种类型的酶也可以被克隆和表达。实验表明，对于本原有差异的脂肪酶来说，虽然其在氨基酸组成序列部分有着较大的差异，但它们拥有类似的三级结构。对于脂肪酶来说，绝大部分酶活性区域残基是由Ser、Asp和His组合而成的“催化三联体”^[7]，它的活性位点通常被一个同时具有亲水性和疏水性的α螺旋“盖子”笼罩，以此来保护三联体催化部位。对于不同来源脂肪酶来说，“盖子”大小以及“盖子”打开后活性位点附近疏水性区域大小也不尽相同。“盖子”外表面亲水，内表面疏水。脂肪酶在水中具有良好的溶解性，其原因是在水相中脂肪酶“盖子”上的亲水性部位朝外；在疏水性底物或有机溶剂的诱导下，盖子被打开，脂肪酶的活性位点及附近疏水区域暴露。根据以上机理，该酶会和油-水界面相互缔合在一起，“盖子”被开出来，会将活性部分袒露出来，从而提高了酶和底物的接触结合力，同时让底物可以比较方便地走进疏水通道中，与活性部位彼此联合在一块儿，最终产生酶-底物复合体。

1.3酶的固定化

1.3.1 固定化酶的性质

把游离酶巩固起来经常被用来增加它的稳定和反复利用性能。酶的固定化技术是将游离酶固定在一定的空间区域内的一类技术，固定后的酶在保持其催化特性的基础上，可以重复利用，有利于降低生产成本^[1]。将酶巩固住是十分有必要的手段，可以优化其于非水介质环境中的机能。

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