论文总字数：20668字

摘 要

共价固定化酶结合牢固，但是固载速率不是很快，比较容易导致蛋白质活性丢失。本文通过聚乙烯亚胺修饰环氧载体，制备同时含有环氧基和氨基的载体，既有离子作用的快速吸附的特点，并保留共价固定化结合牢固的特点。以酶活和蛋白装载量为考察指标，最佳的修饰条件为：3 mg/mL，分子量为10000的聚乙烯亚胺，pH 7.0，60℃，修饰6 h。测定修饰后与未修饰载体的蛋白装载量时间进程曲线，修饰后的载体蛋白装载量在8 h时达到最大值4.617 mg/g，而未修饰的载体在24 h达到最大值6.266 mg/g，其时间缩短了16 h。同时修饰后，固定化酶重复使用6次，仍保留初始酶活的93.21%，而未修饰的只有72.46%，重复使用能力提高。

关键词：脂肪酶 固定化 聚乙烯亚胺 载体修饰

Carrier modifies on immobilized lipase

ABSTRACT

Covalent immobilized enzyme makes a firm combination with protein, but the rate is relatively slow, which causes the loss of the activity of protein. In this paper, PEI modifies epoxy carriers, and in the meanwhile, carriers with epoxy group and amino are made. It features fast adsorption of ionic reaction, and reserves the advantage of firm combination of covalent immobilization. Enzyme activity and loading capacity of protein as investigation targets, the reaction happens providing the best modification condition is 3mg/ml, 10000 PEI of molecular mass, and under the condition of pH 7.0 and 60℃. Drawing the process curve of the protein loading capacity of modified and unmodified carriers, it will be found that the protein loading capacity of modified carriers reaches its maximum, 4.617mg/g after 8 hours; while unmodified carriers reach its peak, 6.266mg/g after 24 hours, which saves 16 hours. At the same time, modified immobilized enzyme maintains 93.21% of its initial enzyme activity after 6 times of reuse; while unmodified only reserves 72.46%, which means improved reusability.

Keywords: lipase; immobilization; PEI; carrier modification

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 2

1.1 课题研究背景 2

1.2 脂肪酶的概述 2

1.2.1 脂肪酶的性质 2

1.2.2 脂肪酶结构及机理 3

1.3 脂肪酶的固定化方法 4

1.4 酶固定化的载体 5

1.5 环氧树脂在固定化脂肪酶的应用 5

1.5.1 环氧树脂的定义 5

1.5.2 环氧树脂的结构性质与固化机理 6

1.5.3 固化后环氧树脂的优缺点 6

1.6 聚乙烯亚胺 7

1.6.1 聚乙烯亚胺的结构与性质 7

1.6.2 聚乙烯亚胺在固定化酶中的应用 8

1.7 本课题研究的目的和意义 8

第二章 材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.1.1 实验试剂 9

2.1.2 实验仪器 9

2.2 实验方法 10

2.2.1 PEI修饰环氧载体 10

2.2.2 氨基检测方法 10

2.2.3 固定化酶的制备方法 10

2.2.4 酶蛋白装载量及吸附率测定方法 10

2.2.4.1 Bradford法测定蛋白含量的标准曲线 11

2.2.5 游离与固定的酶水解活性测定方法 11

2.2.5.1 对硝基苯酚酯法标准曲线的绘制 12

2.2.5.2 游离脂肪酶活性的测定 12

2.2.5.3 固定化脂肪酶活性的测定 13

2.2.6 被固定化酶稳定性测定方法 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 聚乙烯亚胺的分子量的影响 14

3.2 PEI浓度和修饰的时间对蛋白装载量影响 14

3.3 PEI浓度与修饰的时间对固定化酶酶活的影响 15

3.4 不同pH对载体修饰固定化脂肪酶的影响 16

3.5 时间对载体修饰固定化酶蛋白装在量的影响 17

3.6 载体修饰固定化酶的酶活时间进程曲线 18

3.7 固定化脂肪酶重复使用能力 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望及进一步工作的建议 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1 课题研究背景

酶是活细胞体生成的一类天然催化剂。在常温、常压等不剧烈的反应条件下，可以指定促成某一些化学反应的产生，但自己本身却可以不参与反应，其具有很高的选择性，高催化性，条件比较温和，耗能少，反应可以被控制和环保不污染环境等一系列优点。正是这些优点，其易一被发现就在化工业、药物、医药等领域有广泛的运用。但处于游离状态的酶对环境很敏感，在高温、高压、强酸、强碱以及有机溶剂中，蛋白质很容易变性，从而可以导致酶活能力的降低或者彻底的失活。除此以外，酶的价格比较高而且分离提纯比较困难，使得产率降低和生产成本增加^[1]。这些缺点让游离态的酶不能满足工业等领域的连续和自动化生产的需要，酶的发展停滞不前。为克服这一难关，人们对其进行了深入的研究。20世纪中期，酶固定化出现在大家的视野里。此技术是指运用物理或化学的方案，将酶限定或是控制在一定的区域内，仍然具有催化反应的能力，而且是可以循环利用的一种新的技术^[2,3]。通常固定化方式主要包含像包埋、吸附、交联结合和共价法等等。固定后的酶可以提高其相应稳定性、最适宜温度与最适宜pH值。可以与底物、产物更加容易分离开来，酶生产的纯化工序简单化了，生产成本得到减少；可循环多次使用，缩短了生产周期；增加产物的收率，提高产物质量。酶固定会有很难忽视的劣势，比如酶活力容易遭到丧失，生产费用相应随之会增长。影响酶固定质量的原因就是固定方法和载体材料。所以研究工作者正从这两方面着手，来提高固定化酶的质量^[4]。

1.2 脂肪酶的概述

1.2.1 脂肪酶的性质

脂肪酶是一种三酰基甘油酰基水解酶，可以催化油脂进行水解，从而生成了脂肪酸、甘油、甘油单酯或者二酯。脂肪酶绝大部分是真菌与动植物里面。脂肪酶在体脂代谢中是不或缺的一部分，在大自然中拥有着非常丰富的微生物来源^[5]。它的基本构成单位为氨基酸，它通常只有一条多肽链，而蛋白质结构则又决定了其催化活性。一般来说，脂肪酶是两极性分子，这是脂肪酶与其他酶类的不同部分之处，该界面对脂肪酶有界面活化的作用。拥有不同催化能力的脂肪酶，在油水界面上含有激活性质，所以是能在油水界面上来催化三酰甘油酯以及另外不溶性酯类的水解、醇解、酯化、及酯类等一些合成反应，是目前被重点研究的酶^[6]。

脂肪酶具有以下突出的特点：（1）有机溶剂中稳定性高。（2）底物特异性广。（3）选择特异性强。（4）高催化活性。（5）副反应较少。由于脂肪酶的以上特点以及优势，它已经被用于工业、食品、新型生物材料、医学、生物等领域^[7]。随着非水相酶的发展，酶逐渐在非水相里可以进行催化酯化、酯交换和转酯化反应，同时其选择性、专一性都很高，已经被用在医学、食品、化妆品、工业等多个领域。

1.2.2 脂肪酶结构及机理

其可以拆分醇、胺和硫酯等物质^[8,9]，特别是2-醇或者羧酸酯的动力学拆分。其中脂肪酶，酯酶、蛋白酶（作用于酯）都遵循相似机理^[10]，首先是酶活性部份中亲核基团来攻击酯酰基。其中脂肪酶、酯酶和蛋白酶中所含的亲核基团都可以是丝氨酸的羟基^[11,12]。对于其他某些蛋白酶而言，它是一个天冬氨酸的羧基或者是一个半胱氨酸的巯基功能基^[13]。通常一个丝氨酸、一个组氨酸与一个天冬氨酸中的残基(Ser-His-Asp)组合形成“催化三联体”是大多数脂肪酶活性部份。其中活性部份通常可以被盖住，但是在有底物或者是有机溶剂条件下，就可以打开盖子。结果，活性部分与底物接近^[14]变得更加容易。脂肪酶所催化酯化或者是相反方向水解反应都是遵照乒乓bi-bi这一原理^[15]。这样三种氨基酸中含有的氢键进行重新组合，提高色氨酸残基亲核能力，可以攻击酰基供体里面的羰基，从而得到了“酰-酶的复合体”。最后，其底物可以更好攻击酰-酶复合体从而产生了新鲜的产物。

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