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摘 要

目的：利用液态芯片技术在检测食管癌患者血清骨桥蛋白(OPN)水平中的可行性，以探讨该因子在食管癌中的应用。方法：运用Luminex 3D技术，以26例健康人样品先建立OPN因子检测方法，确定标准品和样品稀释倍数。再对26例食管癌患者血清样本进行检测，对产生的数据进行统计学分析。结果：食管癌患者血清中OPN均值为55.42±20.95ng/ml，高于正常人血清中OPN的均值34.73±13.13ng/ml，经SPSS13.0软件分析得出两者差异具有统计学意义（plt;0.01）。结论：液态芯片技术适用于临床大量样本的血清OPN的检测，这对食管癌患者的早期诊断、预后和疗效评价起到了重大意义。

关键词：食管癌；液态芯片法；Luminex

ABSTRACT

Purpose: We use Luminex technology in the detection of serum osteopontin（OPN） levels of patients with esophagus cancer in the feasibility to explore this factor in gastric Application. Method: We use Luminex 3D technology, establishing OPN factor detection method to determine the dilution of standards and samples in the 26 cases of healthy people sample. And we detect the 26 cases of patients with esophagus cancer, then statistically analyze the resulting data. Result: Average concentration of serum OPN of patients with esophagus cancer was 55.42±20.95ng/ml, higher than the average normal serum OPN concentration 34.73±13.13ng/ml. The difference analyzed by SPSS13.0 software was statistically significant(plt;0.01). Conclusion: Luminex technology is suitable for clinical detection of a large number of samples’ serum OPN, this played a major significance in early esophagus cancer diagnosis, prognosis and efficacy evaluation.

Keywords: OPN; Esophagus cancer; Luminex

目录

ABSTRACT 3

第一章 文献综述 6

1.1 食管癌 6

1.1.1 概述 6

1.1.2 发病情况 6

1.1.3 发病机制 7

1.2 肿瘤标志物 8

1.2.1 概述 8

1.2.2 应用 8

1.3 骨桥蛋白(OPN) 8

1.3.1 OPN概述 8

1.3.2 OPN的蛋白结构 9

1.3.3 OPN的生物学作用 10

1.2.5 OPN的病理功能 11

1.3.4 OPN与肿瘤的关系 11

1.2.8 检测OPN因子的常用方法 12

1.3 液态芯片法 14

1.3.1 液态芯片法概述 14

1.3.2 工作原理 14

1.3.3 xMAP 3D液态芯片重要组成部件 15

1.3.4 FLEXMAP 3D^TM 的突出特点 16

第二章 实验部分 17

2.1 研究对象 17

2.2主要仪器和试剂 17

2.3 实验方法 18

2.3.1准备试剂（在试剂准备区操作） 18

2.3.2标本制备及加样 18

2.3.3标准品配置 18

2.3.4设置阴性质控品 19

2.3.5设置阳性质控品 19

2.3.6加样操作 19

2.3.7蛋白质定量检测 19

第三章 实验结果 20

3.1 OPN标准曲线的绘制 20

3.2 食管癌患者与健康体检者血清中OPN信号值的比较 20

3.3 不同的样本稀释倍数 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

4.2.1 OPN对食管癌检测的意义 22

4.2.2 液态芯片技术的发展前景 23

参考文献 25

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1 食管癌

概述

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，是常见的消化道肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％，全世界每年约有20万人死于食管癌。食管癌的发生与亚硝胺慢性刺激，炎症与创伤，遗传因素以及饮水，粮食和蔬菜中的微量元素含量有关，但确切原因不甚明了，有待研究探讨。其发病率和死亡率各国差异很大。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。此病的预后要看病症不同的程度而定，但普遍来说都是极差的。

发病情况

   年食管癌新发病例31.04万，我国占16．72万。我国食管癌死亡率通常男性高于本病发病情况在不同国家相差悬殊，即使在同一国家的不同地方或不同民族之间也可有明显差异。欧、美和大洋洲诸国的食管癌发病率一般在2～5/10万（但法国例外，达13.6/10万），前苏联的中亚地区高达100/10万以上。亚洲诸国家的发病率为1.2～32/10万，但伊朗的黑海沿岸地区则高达100/10万能以上。但近年来40岁以下发病者有增长趋势。食道癌的发生与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。
   1980年我国男性食管癌发病率为21.0/10万，为男性恶性肿瘤第2位；女性发病率为12.3/10万，为第3位。全世界每女性，如1990年部分城市统计，男性为13.23/10万；女性为5．96/10万；部分县统计，男性25．77/10万，女性15．62/10万，即男女之比约为2:1；患病年龄多在50，以中段最多见（57.2％），下段次之（29.6％），上段最少（13.1％）。
   食道癌在我国有明显的地理聚集现象，高发病～69岁之间（占60％），30岁以下较少见。食管癌在食管上、中、下三段的分布率及高病死率地区相当集中。对流行地区分布的深入分析发现，同一省的不同地区可以存在迥然不同的发病情况，高、低水平地区相距很近，而病死率水平却可相差几十倍到二、三百倍。由高病死率水平到低病死率水平常形成明显梯度，呈不规则同心圆状分布。主要的高病死率水平地区分布在：河南、河北、山西三省交界(太行山)地区；四川北部地区；鄂豫皖交界(大别山)地区；闽南和广东东北部地区；苏北以及新疆哈萨克族聚居地区。在世界范围内同样存在高发区，哈萨克斯坦的古里亚夫、伊朗北部的土库曼、南非的特兰斯开等，其发病率均超过100/10万。

1.1.3 发病机制

目前食道癌的病发已经常见，主要的病变出现在食管上，引起饮食上的困难，因此，食道癌患者往往容易出现营养不良等症状，而食道癌的发病因素极为复杂，具有多种多样的病因，其发生与该地区的饮食习惯、存在强致癌物及有遗传易感性等有关，有待深入探索。以下是近几年来，有关人员在食道癌病因上，根据该病症的高发区做出的有关推断：（1）饮食刺激与食管损伤、食管疾病：一般认为食物粗糙、进食过烫，咀嚼槟榔或烟丝等习惯，造成对食管黏膜的慢性理化刺激，可致局限性或弥漫性上皮增生，形成食管癌的癌前期病变。食管损伤和某些慢性食管疾病如腐蚀性食管灼伤和狭窄、胃食管反流病、食管贲门失弛缓症或食管憩室等，由于食管内容物滞留而致长期的慢性炎症、溃疡或慢性刺激，引起食管上皮增生，导致癌变。（2）遗传因素：食管癌的发病常表现家族性聚集现象。在我国高发地区本病有阳性家族史者达25％～50％，其中父系最高，母系次之，旁系最低。食管癌高发家族的外周血淋巴细胞染色体畸变率较高，可能是决定高发区的食管癌易感性的遗传因素。调查还发现林县高发区居民迁至他县后，食管癌发病率与病死率仍保持较高水平。这些现象说明遗传与食管癌有一定的关系。（3）营养不良和微量元素缺乏：无论国内外，食管癌高发区都在贫困不发达地区，自然条件差，水资源少，物产不丰，食品匮缺。饮食缺乏动物蛋白、脂肪、新鲜蔬菜和水果。摄入的维生素A、B：和C缺乏。流行病学调查表明，食物、饮水和土壤内的元素钼、铜、硼、锌和铁含量较低。这些都可能与食管癌的发生间接相关。如微量元素钼是某些氧化酶和硝酸盐还原酶的重要组成成分，钼缺乏可以引起植物中硝酸盐的积聚。（4）亚硝胺类化合物和真菌毒素：①真菌毒素的致癌作用：各种霉变食物能产生致癌物质。镰刀菌、白地霉菌、黄曲霉菌和黑曲霉素等真菌不但能还原硝酸盐为亚硝酸盐，并能增加二级胺的含量，促进亚硝胺的合成。在邻近真菌感染侵犯部位的食管上皮细胞，可呈现单纯性增生、轻度至重度的不典型增生，甚至明显的癌变。在食管原位癌旁增生上皮内可分离出白色念珠菌的纯株。故食管真菌病可能是食管癌的癌前病变之一。②亚硝胺 是被公认的化学致癌物，其前体包括硝酸盐、亚硝酸盐、二级或三级铵等，普遍存在于高发区的粮食和饮水中，含量高，且与当地食管癌和食管上皮重度增生的患病率呈正相关。这些物质在胃内酸性条件下，特别是在维生素C摄入不足时，胺类和亚硝酸盐易合成亚硝胺。国内已成功用甲苄亚硝胺、肌胺酸乙酯亚硝胺、甲戊亚硝胺和二乙基亚硝胺素诱发大鼠的食管癌。并证实亚硝胺能诱发人食管鳞状上皮癌。

• 1. 肿瘤标志物

概述

肿瘤标志物指存在于血液、体液和组织中可检测到的与肿瘤的发生、发展有关的物质，其或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织中的含量，其存在或量变可提示肿瘤的性质，从而了解肿瘤的发生、细胞分化及功能，在肿瘤的诊断、分类、预后和复发判断及指导临床治疗中起辅助作用。

应用

肿瘤标志物在医学方面有如下应用：肿瘤普查、筛选项目；肿瘤诊断与鉴别诊断；疗效与预后判断；生物特点和疾病阶段的判定；手术、化疗、放疗的监测；确定不知来源的转移肿瘤的原发肿瘤以及多项肿瘤标志物的联合应用，提高检测效率。

• 1. 骨桥蛋白(OPN)

OPN概述

OPN作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织和细胞中，其相对分子质量约为44 kDa，约含300 个氨基酸残基，其中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸残基占有很高的比例，约占总氨基酸量的一半。OPN有明显促进肿瘤恶化的倾向，有可能成为一种新的肿瘤标志物^[1]。OPN在肿瘤发生、发展及转移过程中主要表现为：诱导细胞转化和增殖；削弱免疫细胞肿瘤杀伤作用；促进肿瘤血管的生成和局部膜结构的破坏；介导细胞与细胞外基质的黏附^[2,3] 。

OPN 通过与一些整合素受体和CD44 受体结合，激活细胞内相关信号通路，从而促进肿瘤细胞的趋化、黏附和迁移。OPN 在肿瘤发生、发展及转移过程中的作用主要为诱导细胞转化和增殖，削弱免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，促进肿瘤血管的生成和局部膜结构的破坏，介导细胞与细胞外基质的黏附。众多研究表明， OPN 与肿瘤的发生、转移和预后有关。Pan等^[4]研究发现，OPN 在肝癌中表达与肿瘤的大小、分期以及甲胎蛋白(AFP) 的表达水平相关。部玉峰等^[5]报道， OPN在有转移的肝癌中的表达明显高于无转移肝癌中的表达。朱耀魁等^[6]报道，OPN 与卵巢恶性肿瘤细胞的侵袭、转移、疾病的严重程度及预后密切相关。段波等^[7]发现OPN 的表达与膀胱肿瘤的分级、分期、复发和转移有密切关系^[8-10]。

OPN的蛋白结构

OPN作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织和细胞中，其相对分子质量约为44kDa，约含300个氨基酸残基，其中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸残基占有很高的比例，约占总氨基酸量的一半。OPN多肽链的二级结构中包括8个α螺旋和6个β折叠结构，高度保守的RGD基元两端各有一个β折叠结构，分子中心部位是α螺旋结构。OPN分子中约含有30个寡糖基，其中10个是唾液酸。

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