论文总字数：17866字

摘 要

5-氟-2'-脱氧尿苷是一种非常有效的抗肿瘤药物，相比较于化学法合成，酶法合成在立体选择性、区域选择性、保护/脱保护方面有着非常明显的优势。本研究用Brevibacillus borstelensis LK01来源的重组嘧啶核苷磷酸化酶催化2'-脱氧尿苷和5-氟尿嘧啶高效合成5-氟-2'-脱氧尿苷。反应条件优化结果表明：pH 8.0、温度55 °C、2'-脱氧尿苷:5-氟尿嘧啶=5:1、酶添加量2.0 U/mL、反应1 h转化率最高，达72.45 %。利用液相制备柱分离出产物，质谱分析产物分子量为246.06，与5-氟-2'-脱氧尿苷分子量大小一致，初步实现了5-氟-2'-脱氧尿苷的高效酶法转化。

关键词：酶法合成 5-氟-2'-脱氧尿苷 尿苷核苷磷酸化酶 反应条件优化

Enzymatic synthesis 2'-deoxy-5-floxuridine

ABSTRACT

2'-deoxy-5-floxuridine is an effective anti-tumor agent.When compared with chemical synthesis, enzymatic synthesis has distinct advantages in many aspects, such as stereo-selectivity, regioselectivity and protection/removal protection. In this study, we used recombinant pyrimidine nucleoside phosphorylase, which comes from Brecibacillus borstelensis LK01, to catalyze synthesis of 2'-deoxy-5-floxuridine efficiently by using 2'-deoxy-uridine and 5-fluorouracil as substrates. The highest conversion is obtained with the reaction time of 1 h at 55 °C and pH 8.0, when the concentration of substrates ratio is 5:1. The optimum amount of the enzyme is 2.0 U in 1 ml solution. The highest conversion rate is 72.45%. The product was isolated by HPLC. The result of mass spectrometer shows that the molecular weight of product is 246.06, which is the same to the molecular weight of 2'-deoxy-5-floxuridine. In this study, we accomplish the initial purpose of efficiently enzymatic synthesis of 2'-deoxy-5-floxuridine.

Key Words: enzymatic synthesis; 2'-deoxy-5-floxuridine; uridine nucleoside phosphorylase; optimizing the condition of reaction

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第1章 文献综述 1

1.1 5-氟-2'-脱氧尿苷 1

1.1.1 5-氟-2'-脱氧尿苷简介 1

1.1.2 5-氟-2'-脱氧尿苷的合成方法与对比 1

1.2 酶法合成5-氟-2'-脱氧尿苷 2

1.2.1 酶法合成5-氟-2'-脱氧尿苷原理 2

1.2.2 酶法合成5-氟-2'-脱氧尿苷研究进展 3

1.2.3 酶法合成5-氟-2'-脱氧尿苷存在的问题 4

1.3 本课题研究意义和研究内容 4

第2章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌株与质粒 5

2.1.2 实验试剂 5

2.1.3 主要设备及仪器 7

2.1.4 培养基 7

2.1.5 电泳相关溶液 8

2.1.6 电泳凝胶配制 9

2.2 尿苷磷酸化酶的获得 10

2.2.1 重组菌的发酵 10

2.2.2 菌体破碎与粗酶液的获得 10

2.2.3 酶的纯化 11

2.3 酶法合成5-氟-2'-脱氧尿苷条件优化 11

2.3.1 标准曲线的制作 11

2.3.2 尿苷磷酸化酶的催化反应体系 12

2.3.3 反应pH的优化 12

2.3.4 反应温度的优化 12

2.3.5 反应时间的优化 13

2.3.6 酶量的优化 13

2.3.7 底物摩尔比的优化 13

第3章 结果与讨论 14

3.1 Brevibacillus borstelensis LK01来源的核苷磷酸化酶的制备 14

3.2 反应pH的优化 14

3.3 反应温度的优化 15

3.4 酶量的优化 16

3.5 底物比的优化 17

3.6 反应时间的优化 17

3.7 产物质谱分析 18

第4章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

第一章 文献综述

1.1 5-氟-2'-脱氧尿苷

1.1.1 5-氟-2'-脱氧尿苷简介

核苷及其衍生物作为一类抗代谢药物，它在治疗病毒感染以及肿瘤化疗方面有着显著的作用^[1-2]。近年来不断有研究表明有着许多的新型的、可能具有开发成抗肿瘤药物潜力的核苷衍生物，但是真正能够通过新药研发与检验进入临床使用的相对较少。1957年，5-氟尿嘧啶首次被人工合成，直至目前仍是治疗多种恶性肿瘤的主力药物，但是毒性较大而且扩散能力不佳以及长期使用导致的抗药性已经使得5-氟尿嘧啶的作用越来越弱^[3]。

5-氟-2'-脱氧尿苷是5-氟尿嘧啶的一种前体药物，属细胞周期特异性抗代谢药物,其在体内可代谢转化成氟尿嘧啶，与5-氟尿嘧啶具有相同的抗肿瘤谱，但毒性较小且活性高^[4]。它通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶的方式，阻断尿嘧啶脱氧核苷酸转化为胸腺嘧啶核苷酸，从而影响DNA合成^[5-7]，起到抑制病毒复制或肿瘤生长的作用。临床上主要用于乳腺癌、肝癌、胃肠系统癌症和头颈部肿瘤等。

1.1.2 5-氟-2'-脱氧尿苷的合成方法与对比

请支付后下载全文，论文总字数：17866字