论文总字数：19095字

摘 要

天然产物作为生物的次级代谢产物，拥有良好的生物顺应性，以及维持生物生理活动的功能。对天然产物进行糖基化修饰，不仅可以改善其水溶性，同时也可抑制微生物糖基化过程。糖基化方法有多种，本文则采用具有产物专一性好、步骤简易化、收率高等优点的生物法，即以糖基转移酶作为糖基化工具。糖基转移酶是广泛存在的一大类酶，主要存在于植物中，是自然界中主要用于转移糖基的酶类，但由于这类酶在实际中很难提取分离，所以其应用范围大大地被限制。

本课题以实验室菌库为基础，利用基因工程技术克隆糖基转移酶基因，以及构建表达载体，实现糖基转移酶基因在大肠杆菌内的异源表达，同时，通过不断的改善优化异源表达条件，使糖基转移酶得到高效表达，为天然产物的合成奠定新的基础。本研究的开展对于深化天然产物的应用具有重要借鉴意义。

关键词：天然产物 糖基转移酶 大肠杆菌 克隆表达

Cloning and expression of glycosyltransferase enzyme applied to natural product glycosylation

Abstract

As biological secondary metabolites, natural products have a good biological compliance, and the function of maintaining biological physiological activity. Glycosylation of natural products , can not only improve its water-soluble, but also inhibit microbial glycosylation. There are several glycosylation methods, and the paper uses biological methods that the glycosyltransferase is used as glycosylation tools, which is good with product specificity, step facilitation and high yield of product. Glycosyltransferase is a large class of ubiquitous enzymes, mainly in plants. The enzymes are those that are used for the transfer of a sugar group. But since these enzymes are difficult to extract isolated in practice, so its application range is greatly restricted.

Based on laboratory strain library, this study is aimed at cloning glycosyltransferase genes and constructing an expression vector, as well as achieving glycosyltransferase gene heterologous expression in E. Coli by the use of genetic engineering. Meanwhile, through continuously optimizing the conditions of heterologous expression, the study make the glycosyltransferase be highly expressed, laying a new foundation for the synthesis of natural products. The development of this research has an important referential significance for deepening the application of natural products.

Keywords: Natural products ; Glycosyltransferase ; E. Coli ; Cloning and expression

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 天然产物的合成与修饰方法 1

1.1.1化学法 1

1.1.2生物法 2

1.2 糖基转移酶的介绍 2

1.2.1糖基转移酶的分类 2

1.2.2糖基转移酶的作用机制 3

1.2.3糖基转移酶的重要用途 3

1.2.4糖基转移酶的研究现状 3

1.3 本课题的研究内容与意义 4

1.3.1 研究内容 4

1.3.2 研究意义 4

第二章 糖基转移酶的克隆 5

2.1实验材料 5

2.1.1 实验仪器 5

2.1.2 实验试剂 5

2.1.3 培养基 6

2.2 产糖基转移酶筛选菌株的菌种鉴定 6

2.2.1基本原理 6

2.2.2培养基 6

2.2.3实验仪器 6

2.2.4实验方法 7

2.2.4.1细菌基因组的提取 7

2.2.4.2 16S rDNA的PCR扩增 7

2.2.4.3 连接 8

2.2.4.4 测序 9

2.3 糖基转移酶基因的扩增与表达 9

2.3.1 基本原理 9

2.3.2 蜡样芽孢杆菌糖基转移酶基因的扩增 9

2.3.2.1 BC-GT1基因的扩增 9

2.3.2.2 连接 10

2.3.2.3 测序 11

2.3.3 蜡样芽孢杆菌糖基转移酶基因表达载体 11

2.3.3.1表达引物的设计 11

2.3.3.2表达载体的构建 11

2.3.3.3表达载体的转化 13

2.3.3.4菌落PCR 14

2.3.3.5阳性克隆的筛选、双酶切鉴定及测序 14

2.5 结果与讨论 15

2.5.1 蜡样芽孢杆菌糖基转移酶基因组DNA的提取 15

2.5.2 蜡样芽孢杆菌糖基转移酶基因的扩增 15

2.5.3 蜡样芽孢杆菌糖基转移酶基因表达载体的构建 16

2.5.4 质粒pET-28a的提取与纯化 17

2.5.5 质粒pET-28a的双酶切 17

2.5.6 菌落PCR检测 17

第三章 糖基转移酶的诱导表达 19

3.1 糖基转移酶BC-GT1在大肠杆菌内的诱导表达 19

3.1.1 实验方法 19

3.1.2 实验结果与讨论 19

3.2 糖基转移酶BC-GT1异源表达条件优化 20

3.2.1 最适诱导温度 20

3.2.2 最适诱导剂及添加量 21

3.2.3 实验结果 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 天然产物的合成与修饰方法

天然产物作为生物的次级代谢产物，拥有良好的生物顺应性，以及维持生物生理活动的功能。对于微生物而言，由于大部分疾病与微生物有关，且致病环节都有天然产物糖基化的步骤^[1]，故若能在充分研究糖基化过程的基础上抑制微生物的糖基化过程，从而抑制其生理活动，那这种过程的实现将会对于与微生物有关的疾病防治产生巨大的促进推动作用。

同时，部分天然产物还具有显著的药理活性，例如一些植物所生成的皂苷类化合物^[2-3]，其表达过程进来也成为研究热点，相比较人工合成的化学药物，天然产物副作用小，对于慢性治疗有非常好的疗效，可是由于大部分天然产物的结构相对较复杂、生物利用度较低、在自然界中极其微量，很难确定有效成分，所以我们必须要对天然产物进行人工合成或者结构修饰，或者通过基因工程技术使得天然产物得到高效表达，使其满足作为药物的要求。例如一些天然产物的水溶性较低，经糖基化修饰后所得的糖苷类化合物，其水溶性有了一定程度的提高，其生物利用度也有相应的增加，毒副作用降低；另外，对于一些尺寸较小的天然产物，糖基化可增强其细胞膜受体靶向性，进而提高了细胞对天然产物的吸收利用^[4-5]。同时，在对植物的次级代谢产物的转化途径参与酶的研究基础^[6-9]上，以及清楚相关表达基因的前提下，对其基因进行提取和克隆，然后将特定基因与表达载体结合，并导入细菌内表达，从而高效生产出特定用于合成天然产物的糖基转移酶，进而为之后的天然产物合成奠定一定的基础。

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