论文总字数：19955字

摘 要

丙酮丁醇梭菌是一种著名的产生物丁醇的模式菌株。生物丁醇具有多种优良特性，广泛应用于工业和能源领域。研究发现，当提供载体时，菌体会大量聚集并形成生物被膜。与浮游状态相比，生物被膜生存方式使得丁醇耐受性增强和丁醇生产效率显著提升。目前，关于丙酮丁醇梭菌生物被膜的形成相关的研究报道较少，不利于生物被膜的基础研究。本研究利用Clostron等基因失活技术，挖掘丁醇梭菌生物被膜的关键调控基因，为研究丁醇梭菌生物被膜的分子形成机制奠定基础。

课题组前期对丙酮丁醇梭菌生物被膜转录组学和蛋白组学的分析，并利用Clostron和Crispr技术对生物被膜潜在关键基因进行失活。通过对突变菌株进行发酵，生物量检测、载玻片成膜、菌种扩散能力、TEM观察等实验研究，发现Δcac2730，Δspo0A和ΔpflB突变菌株无法形成生物被膜。敲除cac3059后，细胞的吸附成膜能力有所减弱。通过以上实验，证明了spo0A、cac2730为丙酮丁醇梭菌生物被膜的关键调控基因。

关键字：丙酮丁醇梭菌 生物被膜 spo0A cac2730

Identification of key membrane-forming genes of Clostridium acetobutylicum

Abstract

Clostridium acetobutylicum is a well-known model strain producing butanol. Biobutanol has many excellent characteristics and is widely used in industry and energy. The study found that when a carrier is provided, the bacteria will gather in large quantities and form a biofilm. Compared with the planktonic state, the biofilm survival mode makes the butanol tolerance increase and the production efficiency of butanol significantly improved. At present, there are few research reports on the formation of C. acetobutylicum biofilm, which is not conducive to the basic research of biofilm. In this study, Clostron and other gene inactivation technologies were used to mine the key regulatory genes of C. butanosus biofilm, which laid the foundation for the study of the molecular formation mechanism of C. butanosus biofilm.
In the early stage, the research group analyzed the transcriptomics and proteomics of C. acetobutylicum biofilm, and used Clostron and Crispr technology to inactivate potential key genes in the biofilm. Experimental studies on fermentation of mutant strains, biomass detection, film formation on slides, diffusivity of strains, and TEM observation revealed that Δcac2730, Δspo0A, and ΔpflB mutant strains could not form biofilms. After knocking out cac3059, the cell's ability to adsorb and form a membrane was reduced. Through the above experiments, it was proved that spo0A and cac2730 are the key regulatory genes of C. acetobutylicum biofilm.

Key words: Clostridium acetobutylicum；Biofilm；spo0A；cac2730

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 生物被膜 1

1.1.1 生物被膜的介绍 1

1.1.2 生物被膜的结构与组分 1

1.1.3 生物被膜的形成 2

1.1.4 生物被膜的功能 4

1.1.5 生物被膜的应用 5

1.2 丙酮丁醇梭菌的生物被膜 5

1.2.1 丙酮丁醇梭菌生物被膜的介绍 5

1.3 丙酮丁醇梭菌的基因敲除技术 6

1.3.1 基因敲除的手段 6

1.4 本文的研究内容及研究意义 7

1.4.1 研究内容 7

1.4.2 研究意义 8

第二章 实验材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.1.2 实验仪器 10

2.1.3 实验试剂 12

2.2菌株与实验方法 14

2.2.1 菌株与质粒 14

2.2.2 菌株培养方法 14

2.2.3 基因敲除 15

2.2.4 生物量检测 18

2.2.5 载玻片成膜实验 18

2.2.6 菌种扩散能力实验 18

2.2.7 丙酮丁醇梭菌观察法 19

第三章 实验结果与讨论 20

3.1 实验结果 20

3.2 实验讨论 24

结论与展望 25

参考文献 26

致谢 28

第一章 文献综述

1.1 生物被膜

1.1.1 生物被膜的介绍

微生物生成的生物被膜能够保护其正常生长。大部分微生物的生长过程中都有生物被膜的参与^[1]。科学研究表明，自从Antonie V L在牙菌斑中发现了生物被膜后，随着生物被膜被慢慢发掘，发现拥有生物被膜的细菌相比于浮游类的细菌来说数量更多，尤其是细菌在绝大多数的物体表面都以生物被膜的形式存在。

1.1.2 生物被膜的结构与组分

从20世纪80年代到90年代，伴随着光电聚焦显微镜等高科技产品的出现，人们慢慢的发现了生物被膜的精确结构，逐渐对其形成机理进行了一些研究。Lawrence等人通过激光共聚焦显微镜观察了荧光假单胞菌、副溶血弧菌和铜绿假单胞菌的生物被膜切片，找到了许多不同种类细菌生物被膜的不同三维结构，并特异性附着在不同的表面^[2]。这种三维结构中含有大量水分和细菌。除此之外，还生物被膜中还有许多大分子物质，例如脱氧核糖核酸、蛋白质、磷酸、核糖核酸和多糖。Whittaker等人发现细菌通过粘附和共聚形成牙菌斑生物被膜^[3]，并研究了口腔细菌如链球菌和放线菌的粘附机制。细菌生物被膜的结构相对复杂。Habash等人建立的成熟生物被膜模型将生物被膜分为：大量生物被膜、连接膜、调理膜和亚层^[4]，如图所示。生物被膜中的浅层细菌被自身分泌的胞外多糖包裹，形成小菌落，小菌落分布在复杂的通道网络中，可以运输营养物、酶、代谢废物等。然而，生物被膜深层的细菌不易获得营养和氧气，其代谢率相对较低。他们大多数都处于休眠状态。它们通常不经历频繁的细胞分裂，通常体积小，并且对杀真菌剂不敏感。

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