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摘 要

2损失，不仅造成了碳原子的流失，CO₂的大量排放亦进一步加剧了“温室效应”。最新研究表明，青春双歧杆菌中存在一个与EMP途径并行的非氧化糖酵解途径（NOG）路径。本实验通过磷酸转酮酶(Fpk)活力测定以及NOG系统关键前体胞内乙酰辅酶A浓度的测定系统检测了前期已构建的基于非氧化磷酸化途径（NOG）大肠杆菌L-苹果酸生产菌株NOG模块的表达性能。实验发现Fpk的表达使乙酰磷酸浓度提高了98.2%，Fpk和果糖-1，6二磷酸酶（Fbp）的共同表达时使乙酰磷酸浓度提高了98.4%。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及酶活力测定结果表明磷酸转酮酶在重组菌株中得到正确表达。Fpk的表达使乙酰辅酶A浓度提高了21.7%，Fpk和Fbp的共同表使乙酰辅酶A浓度提高了49.7%。由此可见，NOG系统关键酶Fpk以及Fbp的共同表达，实现了碳从EMP途径转向NOG途径，实现了胞内乙酰辅酶A水平的提高，从而促进L-苹果酸收率及最终产量的提升。关键词：L-苹果酸 糖酵解 非氧化糖酵解途径 乙酰辅酶 磷酸转酮酶 乙酰磷酸

Research on the use of non-oxidative glycolytic pathway to improve the efficiency of carbon

AbstractThe current fermentation of L-malic acid is mainly aerobic production process which usually composed with glycolysis (EMP) pathway and tricarboxylic acid cycle as well as glyoxylic acid pathway. In this process, acetyl-CoA is mainly produced by decarboxylationof pyruvate whereby one carbon equivalent is lost as CO₂ which not only causes the loss of carbon atoms, but also aggravating the "greenhouse effect".Recent studies have shown that a non-oxidative glycolytic pathway (NOG) pathway which parallel to the EMP pathway was found in Bifidobacterium adolescentis.In this study, we determined the efficiency of NOG system in engineered Escherichia coli L-malic acid-producing strain, and then measured the activity of phosphoketolase.The results of SDS-PAGE gel electrophoresis and enzyme activity showed that the transphosphatoketone was correctly expressed in the recombinant strain.The expression of Fpk increased the concentration of intracellular acetyl-CoA by 21.7%, and the concentration of acetyl-CoA was increased by 49.7% with the co-expression of Fpk and Fbp. It can be seen that the co-expression of the key enzymes Fpk and Fbp in the NOG system could drive more carbon flux from the EMP pathway to the NOG pathway and also increased the pool of intracellular acetyl-CoA which benifit to the increase of biomass thereby promoted the yield and titer of L-malic acid.Key words: L - malic acid; Glycolysis ; Non - oxidizing glycolysis pathway (NOG) ; Acetyl-coenzyme; Phosphotransferase; Acetyl-phosphate目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

第二章 文献综述 2

2.1 L-苹果酸 2

2.1.1 L-苹果酸的理化性质及其应用 2

2.1.2 L-苹果酸生产方法及研究进展 2

2.2 微生物有氧发酵过程 4

2.2.1 碳原子利用率较低 4

2.2.2 CO2排放的影响 4

2.3 非氧化磷酸化途径 (NOG) 4

2.3.1 NOG系统机理分析 4

2.3.2 NOG系统的研究进展 5

2.4课题来源及研究内容 7

2.4.1课题来源 7

2.4.2本课题主要研究问题 7

2.4.3本课题采用的研究方法 7

第三章 材料与方法 8

3.1菌株与质粒 8

3.2主要实验试剂 8

3.3主要实验仪器 10

3.4 培养基及培养方法 11

3.4.1 LB培养基 11

3.4.2 培养方式 11

3.5 NOG系统关键酶的表达 11

3.5.1配置培养基 11

3.5.2 SDS-PAGE凝胶蛋白电泳验证 12

3.6 磷酸转酮酶Fpk酶活力的测定 13

3.7 NOG系统关键前体胞内乙酰辅酶A浓度的测定 13

第四章 结果与讨论 15

4.2磷酸转酮酶活力测定 16

4.3 NOG系统关键前体胞内乙酰辅酶A浓度的测定及其对细胞生长的影响 17

4.4 讨论与展望 18

4.4.1讨论 18

4.4.2展望 19

参考文献 20

致谢 23

第一章 前言近年来，全球有机酸工业得到了迅速发展，在有机酸中占有重要位置的L-苹果酸，由于其具有独特的风味、众多的用途而倍受人们的重视^[1]。L-苹果酸作为重要的中间代谢产物，可直接进入三羧酸循环，参与人体代谢，被人体吸收，在线粒体产生能量物质ATP的代谢过程中起到重要作用。其应用前景十分广阔^[2]。L-苹果酸具有抗氧化活性，能够捕获自由基，具有促进抗癌药物及钙离子吸收作用以及其他的保健功能，在食品工业领域也有良好的发展前景。L-苹果酸主要通过有氧发酵过程进行合成，该过程通常是由EMP途径及三羧酸循环以及乙醛酸途径^[3]共同组成的，而糖质在经过EMP途径里的丙酮酸到乙酰辅酶A(乙酰-CoA)的转化过程中会有一分子的CO₂损失，造成了碳流失，一定程度上增加“温室效应”，违背了绿色生物的宗旨。

最新研究发现的在双歧杆菌中存在一个与EMP途径并行的非氧化糖酵解途径（NOG）路径。Fpk将EMP产生的一分子果糖-6-磷酸(F6P)和碳原子重排回补的两分子F6P分解生成三分子乙酰磷酸和三分子赤藓糖-4-磷酸 (E4P)^[4]，三分子的E4P经碳重排又生成两分子F6P。乙酰磷酸继而生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环^[5]。这个路径主要是由两个关键的Fpk和Xpk催化F6P进行碳重排，这个途径的前提是拥有足够的F6P来推动这个路径的运行。 本实验前期研究数据，初始葡萄糖浓度为20 g/L的情况下，E. Coli W1485mdh::Gm/pTrc99a-fpk生产了7.6 g/L苹果酸，收率为0.38 g/g；而E. coli W1485mdh::Gm/pTrc99a-fpk的苹果酸合成浓度达 8.7 g/L，0.435 g/g。本实验通过蛋白电泳验证、检测Fpk的酶活力、检测引入NOG系统后大肠杆菌有氧L-苹果酸生产菌株胞内关键合成前体乙酰辅酶A与乙酰磷酸总量的变化的方法来进一步研究引入NOG系统对于大肠杆菌有氧生产L-苹果酸的影响。

第二章 文献综述

2.1 L-苹果酸

2.1.1 L-苹果酸的理化性质及其应用

L-苹果酸又名羟甲基丁二酸羟基琥珀酸，为结晶性粉末。有较强的吸湿性，室温下在乙醚和乙醇中极易溶解。其分子结构存在活泼性较强的羟基和羧基，易发生氧化反应、醚化反应、酯化反应和酰胺化反应等^[6-8]。L-苹果酸酸性较强^[9]，其1%水溶液的pH为2.4，解离常数（25℃）K₁=4.0 X 10^-4，K₂=9.0 X 10^-6[10]，其分子式为C₄H₆O₅ ，相对分子质量为134.09，熔点为100℃，相对密度为1.595。

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