文 献 综 述

脂肪酶，又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物体内。[1] 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。[2]脂肪酶是最早研究的酶类之一。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及pH范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业上的应用研究也越来越多。[3-5]

目前脂肪酶活性测定方法主要有平板法、滴定法和比色法，其中比色法又包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法。[6]平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长，因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高，但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定；而用硝基苯酚法，实验试剂价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的测定。[7]鉴于目前的检测手段的局限性，所以一种简单、方便和灵敏的检测脂肪酶活性的方法急需建立。

我们研究的课题是探索合成的PCL-PEG-PCL凝胶结合纳米金的良好光学特性，研究一种可视化检测脂肪酶活性的方法。温敏性水凝胶是一种亲水的聚合物网络，对其大量的研究发现，其在凝胶形成过程中不涉及化学反应，分子链间的交联通过分子间相互作用力(范德华力、疏水相互作用及氢键等)形成。通过改变PEG的杂交量就可以影响并改变这些疏水相互作用以及氢键作用，在水中经过简单的可逆性相转变(溶胶-凝胶)即可形成水凝胶。聚己内酯( PCL)是一种被广泛研究的可生物降解的结晶聚合物，共聚物可呈粉末状形态，相比于其它材料在临床使用时更易于处理，而且聚己内酯具有良好的生物相容性、低毒性、疏水性且药物通透性好；而聚乙二醇( PEG)也由于其良好的理化性质，如良好的生物相容性、低毒性、低免疫原性及低抗原性等[8]。PCL和PEG的共聚物被认为无毒、生物相容性好且生物降解速度可调，在生物医用材料领域具有广阔的应用前景[9]。基于上述优点我们采用开环聚合法，抽真空、通氮气，排尽氧气后密封，以辛酸亚锡为催化剂、PEG1000为引发剂，与己内酯单体在120℃油浴中搅拌反应24h发生开环共聚，合成一系列具有不同PEG 和PCL嵌段长度的PCL-PEG-PCL型三嵌段共聚物。[10]产物经冷却溶于二氯甲烷中并用过量石油醚沉淀纯化，将得到的沉淀物真空干燥后即得到PCL-PEG-PCL 嵌段共聚物。[11]经研究证明，温敏性PCL-PEG-PCL型共聚物由疏水的PCL 嵌段和亲水的PEG嵌段组成，其中PCL嵌段起到交联形成的作用，而PEG嵌段则发挥使共聚物分子保留于水中的作用。共聚物的凝胶过程可能包括如下4个步骤：( 1)两亲性共聚物在水中通过自组装形成胶束，此时体系呈澄清的溶胶状态；( 2)随着温度的升高，胶束间的疏水相互作用增强，胶束由不均一的微观胶束网络进一步聚集形成宏观的凝胶。共聚物中亲水的PEG嵌段较大，不易发生大规模的胶束聚集，而是形成相对稀疏的胶束网络，即透明凝胶；( 3)随着温度进一步升高，胶束网络会发生糙化，形成相对致密的胶束簇。当胶束簇尺寸或胶束簇间隔的大小进入可见光波长范围内时，便形成了肉眼可见的不透明凝胶；( 4)当温度过高时，由于共聚物的疏水性过大，导致胶束结构破坏，从而形成浑浊的沉淀。[12]因此，我们必须控制好PEG/PCL的比例和实验温度，以得到我们实验所需要的PCL-PEG-PCL凝胶。根据脂肪酶能水解PCL-PEG-PCL凝胶，我们要将凝胶缠绕在纳米金周围形成保护层，通过脂肪酶水解凝胶酯键，将凝胶保护层破坏，释放出纳米金，在高盐浓度下纳米金聚集变蓝，从而达到我们可视化检测脂肪酶活性的目的。

PCL-PEG-PCL合成路线

纳米金是指金的微小颗粒，通常在水溶液中以胶体金的形态存在。目前最经典的制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法。[13]根据还原剂的种类和浓度的不同，可以在实验室条件下制备出不同粒径的胶体金，且方法简单、原料价廉。胶体金在510-550nm 可见光谱范围内有一吸收峰，吸收波长随金颗粒直径增大而增加。当粒径从小到大时，表观颜色依次呈现出淡橙黄色( lt; 5nm) 、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色变化。胶体金的性质主要取决于金颗粒的直径及其表面特性。由于其直径在1-100nm 之间，而大多数重要的生物分子( 如蛋白质、核酸等) 的尺寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米金作探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程；而它独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。[14]纳米金可以应用于肉眼水平的检测，如斑点金免疫渗滤试验（DIFA）和纳米金免疫层析实验（GICA），可实现对抗原的快速检测。它们基本上采用了一个共同方法，即”抗体-抗原-抗体-纳米金”夹心法。金标抗体与抗原发生专一性反应后出现凝聚，纳米金颗粒聚集，产生肉眼可见的显著的颜色变化。纳米金标记对生物分子的活性影响较小，且能标记很大一部分生物分子，是非常理想的标记物。[15]但人们对纳米金微观物理效应和化学效应的了解还不够充分。随着不断深入研究，必将会使纳米金得到进一步应用。[16]因此，我们将纳米金引入研究中，实现高灵敏度检测脂肪酶水解活性。

参考文献：

[1] 张树政.酶制剂工业.北京: 科学出版社,1984,655-668.

[2] 谈重芳,王雁萍,陈林海,李宗伟,秦广雍,霍裕平.微生物脂肪酶在工业中的应用及研究进展[J] .食品工业科技,2006,07.