摘 要

银杏酸是银杏中除银杏内酷和银杏黄酮之外的另一类活性成分。银杏酸类可看作水杨酸分子在苯环C6位上连有较长侧链取代基的系列化合物,该长链分烷基链和烯基链,由13-17个碳原子组成，主要存在于银杏外种皮中,我国银杏资源丰富,银杏外种皮通常被作为废弃物,造成了资源的巨大浪费。本论文针对银杏外种皮中银杏酸的提取、纯化、分离及其定性定量分析展开研究,主要研究内容和结论如下:

1、首次探讨石油醚提取银杏酸的最佳条件，主要影响因素有四个：提取时间、提取温度、提取次数和溶剂的用量。采用正交试验和单因素相结合的方法，确定了石油醚提取的最佳条件为：采用1:15的料液比，在70℃下回流提取2次，每次1.5h。

2、在总银杏酸硅胶层析法纯化的过程中，研究了不同极性的洗脱剂的洗脱效果，洗脱液采用紫外全波长扫描法和液相色谱相相结合的方法进行确定。最后得出最佳纯化洗脱剂为：石油醚：乙醚：乙酸=90:10:1。同时采用了阴离子交换剂交换法和大孔树脂吸附法对银杏酸粗提物进行了纯化，确定了这两种方法在分离纯化银杏酸的可行性。

3、探究了采用电渗析法分离纯化银杏酸的可行性，并提出采用该办法纯化银杏酸需要克服的困难：接收液的选择，实验室装置的搭配问题。

3、本文采用了紫外扫描、HPLC、对银杏酸进行定性和定量分析。采用紫外扫描，对银杏酸做了定性分析，并且确定了定量分析的检测波长为310 nm。HPLC分析条件：C18（200×4.6 mm）,柱温30℃，流动相为甲醇—0.01 mol/L的磷酸溶液（90:10），流速1.2 mL/min，检测波长310 nm。并计算了每一种银杏酸的相对含量。

关键词：银杏酸, 提取, 纯化, 分析

Abstract

Ginkgoli cacids are a kind of active component in Ginkgo bilobal besides ginkgolides and ginkgoflavone.Ginkgolic acids are 6-alkyl salicylic acids with saturated or up to triple unsaturated n-C₁₃ to n-C₁₇-alkyl residues,which constitute the major component of the lipid fraction in the sarcotesta of Ginkgo bilobal is abundance and it is always wasted In this paper,the separation purification and quantitative,qualitative determination of ginkgolic acids in the sarcotesta of ginkgo bilobal were studied ,the main conclusions as follow:

Firstly we investigate the optimum conditions of petroleum ether to extract ginkgo acid, in which there are four main factors: extraction time, extraction temperature, extraction times and solvent usage. Orthogonal and single factor experiment are combined to determine the optimal conditions for the extraction of petroleum ether: The solid-liquid ratio is 1:15 , refluxing 2 times and 1.5h for a time at 70 ℃.

The elution effect of eluent with different polarities was studied in the process of purification of total ginkgolic acid by silica gel chromatography. The eluent was determined by UV full wavelength scanning and liquid chromatography. Finally, the best purified eluent was: petroleum ether: ether: acetic acid = 90: 10: 1. At the same time, the crude extract of ginkgolic acid was purified by anion exchange method and macroporous resin adsorption method, and the feasibility of separation and purification of ginkgolic acid was determined.

In this paper, UV scanning and HPLC were used to qualitatively and quantitatively analyze ginkgolic acid. The qualitative analysis of ginkgolic acid was carried out by UV scanning, and the detection wavelength was 310 nm. The analytical conditions were as follows: C18 (200 × 4.6 mm), column temperature 30 ℃, mobile phase methanol - 0.01 mol / L phosphoric acid solution (90:10), flow rate 1.2 mL / min, detection wavelength 310 nm And calculate the relative content of each ginkgolic acid.

摘要 3

Abstract 3

第1章绪论 6

1.1银杏外种皮中活性成分研究及进展 6

1.1.1银杏酚酸类 6

1.1.2银杏黄酮类、银杏萜内酯类和银杏多糖类 7

1.2银杏酸化合物的药理研究 8

1.3银杏酸的提取及纯化 9

1.3.1银杏酸的提取方法现状 9

1.3.2银杏酸的纯化工艺 11

1.4本课题的研究内容以及研究目的 14

第2章银杏外种皮中银杏酸提取工艺的优化 14

2.1实验仪器及试剂 14

2.2银杏酸的提取流程 16

2.2.1石油醚提取银杏酸的条件优化 17

2.3本章小结 19

第3章银杏酸纯化的研究 19

3.1硅胶柱层析法纯化银杏酸 19

3.2用阴离子交换剂分离纯化银杏酸 24

3.3用大孔树脂纯化银杏酸 26

3.4用电化学方法纯化银杏酸 26

第1章绪论

1.1银杏外种皮中活性成分研究及进展

银杏是我国特有的珍稀名贵树种，是古老的孑遗植物，有“植物界的活化石”之称。我国的银杏资源占世界总银杏资源的一半以上，位居世界第一位。国内外对银杏叶片、银杏仁的相关研究和报道很多，银杏叶提取物中的活性成分是目前世界上应用最为广泛的辅助治疗心脑血管疾病的天然药物之一^[1]，其药效独特，被广泛用于药物、膳食之中。然而，人们对银杏外种皮的应用却相对很少，据文献表明^[2]，银杏外种皮的重量可占据银杏果重量的四分之三左右，我国每年约有2.4 t万银杏外种皮作为废物丢弃，既污染了环境，又造成极大的资源浪费。因此，加快对银杏外种皮中活性成分的研究进展时更好的利用银杏资源的强力而有效的手段。目前，我们已经认知到银杏外种皮中含有大量的银杏酸，这也是银杏外种皮中主要的毒素来源，同时，我国针对银杏外种皮而开发的保健类产品、美容类产品和生物农药也有了较大程度的进展。

1.1.1银杏酚酸类

据了解，银杏外种皮中含有大量的烃基酚类化合物，其中银杏酚酸可看作是水杨酸分子在苯环C6位上有较长侧链的系列化合物,其侧链的C原子数、双链数、双键位置有所不同。其中以白果酸(Ginkgolic acid,Ⅰ)含量最高,其次是氢化白果酸(Hydroginkgolic acid, Ⅱ),氢化白果亚酸(Hydroginkgolinic acid,Ⅲ),也含有少量的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等成分^[3]。

图1.1银杏酚酸的结构^[3]

仰榴青^[4]用RP-HPLC法测得银杏外种皮中银杏酸的含量为5.46%，用LC-ESI-MS鉴定出5种银杏酸成分 （C13∶0，C15∶0-氢化白果酸，C15∶1-白果酸，C17∶1和C17∶2），各成分相对含量分别为20.7%、3.3%、51.6%、21.1%、3.3%，其中C15：1含量最高，其次是C13：0和C17：1，这3种银杏酸占了总银杏酸的90%以上。可见，银杏外种皮中银杏酸含量较高。王志强^[11]等采用SC-CO2-HPLC测得银杏外种皮萃取液中银杏酸含量为35.95%，其中C13∶0，C15∶0，C15∶1，C17∶1和C17∶2含量分别为7.67%、1.70%、18.88%、6.50%、1.21%。

1.1.2银杏黄酮类、银杏萜内酯类和银杏多糖类

银杏黄酮类

黄酮类物质是银杏提取物中最主要的药效成分，也是治疗心脑血管疾病的主要活性物质。黄酮类物质在银杏叶中的含量是比较少的，只占银杏叶提取物的5.9%^[5]，而在银杏外种皮中的银杏黄酮主要是双黄酮类^[6]，主要包括银杏黄素(ginkgetin)、异银杏黄素(iso ginkgetin)、金松双黄酮(sciadopitysin)、1-5'-甲氧基白果素(1-5'-methoxybilobetin)及白果素(bilobetin)等。黄酮类物质按照化学结构可分为三类：有双黄酮类6中，单黄酮类32种，儿茶素类4种^[7]，儿茶素四种分别是儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸儿茶素和表儿茶素。其中单黄酮类中带有香豆酰基的黄酮苷活性较强，被认为是总黄酮中真正有活性的物质，但其含量较低，而芦丁中含量较高。

图1.2银杏黄酮的分子结构式^[5]

银杏萜内酯类

银杏萜内酯类分为银杏内酯（Gingolides）与白果内酯（Bilbozllide），银杏内酯属二萜内酯，具3 个γ- 内酯环和1个叔丁基团，据其官能团差异可分为银杏内酯A、B、C、J、M 5 种，主要存在于叶片和根内。白果内酯（BB）结构与银杏内酯类似，属倍半萜内酯。

图1.3银杏内酯的结构^[8]

银杏多糖类及其他化合物

银杏提取物中包含单糖类和多糖类物质，其中单糖类共有4种，多糖类有银杏叶多糖-A(LGBP-A)和银杏叶多糖-B（LGBP-B）2 种。银杏外种皮中还含有白果醇(Ginnol)，棕榈酮(Palmitone)，三十烷酸( Triacontanoic acid)，儿茶酚(Pyrocatechol)，原儿茶酸(Protocatechuic acid)，白果宁( Ginkgonine)等。同时还含有氨基酸、鞣质和糖类等成分。

1.2银杏酸化合物的药理研究

(1) 抗菌作用

银杏酸类物质有较强杀菌或抑菌作用,对25种致病性真菌具有抑菌或杀菌作用,对枯草菌、大肠杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿旅杆菌等均有抑制作用^[9]。

(2) 抗氧化作用

许爱华等^[10]研究发现银杏酴酸具有抗氧化和清除自由基的作用，用于日化用品中将具有保持皮肤弹性和增白的效果。

(3) 抗肿瘤和抗病毒

银杏酸性成分中的十七碳烯链水杨酸和银杏黄素均有强抑制EB ( Epstein-Barr)病毒和致癌启动因子的活性。酚酸性成分对小鼠肉瘤S180表现出显著的抗瘤活性^[11]。

（4）抗炎与抗过敏作用

研究发现银杏酸具有与地塞米松类药物相类似的抗过敏性作用，能抑制小鼠被动性皮肤过敏反应(PCA)和大鼠颅骨骨膜肥大细胞颗粒释放，并能直接拮抗过敏介质引起的豚鼠回肠平滑肌的收缩反应，也能拮抗过敏介质如组胺等对豚鼠回肠的收缩，并且银杏酚酸结构中羧基结构完整性与抗过敏反应程度相关。许丽丽等研究表明银杏甲素能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶所致鼠足种胀以及乙酸所致小鼠腹腔毛细管通透性增高。与阳性对照组地塞米松相似，对炎症早期的毛细管渗透性增高，炎性渗出和水肺有很好的抑制作用^[12]。

（5）驱虫、杀虫作用