1. 研究目的与意义（文献综述）

1. 目的及意义

   银杏，系银杏科植物，是我国的特有树种，其果实称为白果。今天，伴随着对银杏叶和白果中的化学成分研究，银杏体现出了重大的生态效益、经济效益。国内外对银杏杏仁、叶子的活性成分的研究已经十分普遍，并取得了多项成果，这些成果在人们日常生活以及医疗保健中发挥了重大的作用；但是对作为占据银杏果实巨大比例的银杏外果皮的研究确实十分缺少，处于研究开发的初级阶段。据调查研究^[1]可知，银杏外种皮占整个种子重量的75%左右，我国每年约有2.4t万银杏外种皮作为废物丢弃，既污染了环境，又造成极大的资源浪费。如果除去外种皮中60%的水分，可得干燥外种皮9600t，比银杏种核的年产量还高。

   所以，对银杏外果皮的研究和开发利用，不但可以更加有效地利用银杏资源，同时也可以减少银杏资源利用的过程中带来的环境污染，从而达到一举多得的目的。

   1.1银杏外种皮

   银杏的外种皮是一层较厚的肉质，是种子外壳外面的部分，俗称白果衣胞，成熟的外种皮呈橙黄色。在银杏产区，银杏外种皮通常被当做废料丢弃，然而外种皮具有致敏毒性，经常为此对果农的手部造成伤害，若将外种皮丢弃在河流里面，则可以使河中的鱼虾等生物中毒死亡。经研究发现, 引起过敏的成分可能为银杏毒素( Ginkgotoxin) 等酸类成分。

   随着研究的深入,银杏外种皮中被发现的化学成分越来越多,目前主要有以下几类:

   
   

   
   

   1.1.1黄酮类

   银杏外种皮中的银杏黄酮,主要是双黄酮类^[2,3],包括银杏黄素(ginkgetin)、异银杏黄素(iso ginkgetin)、金松双黄酮(sciadopitysin)、1-5'-甲氧基白果素(1-5'-methoxybilobetin)及白果素(bilobetin)等。黄酮类物质是银杏提取物中主要药用成分，也是治疗心脑血管疾病的主要活性成分。黄酮类物质按照化学结构可分为三类：有单黄酮类32种，双黄酮类6种，儿茶素类4种^[2]。其中单黄酮类中带有香豆酰基的黄酮苷活性较强，被认为是总黄酮中真正有活性的物质，但其含量较低，而芦丁中含量较高。

1.1.2烃基酚和酚酸类

据了解，银杏外种皮中还有大量的烃基酚类化合物，其中银杏酚酸可看作是水杨酸分子在苯环C6位上有较长侧链的系列化合物,其侧链的C原子数、双链数、双键位置有所不同。其中以白果酸(Ginkgolic acid,Ⅰ)含量最高,其次是氢化白果酸(Hydroginkgolic acid, Ⅱ),氢化白果亚酸(Hydroginkgolinic acid,Ⅲ),也含有少量的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等成分^[4]。




图1.2银杏酚酸的结构^[4]




1.1.3内酯类

楼凤昌^[5]等首次从银杏外种皮中分离得到银杏内酯A和银杏内酯B的混合物以及银杏内酯C。余碧钰^[6]等测得银杏外种皮提取物银杏乙素混合物中,银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯含量分别为4.5%,2.4%,1.9%和3.0%,总量11.8%。表明银杏外种皮中内酯成分与银杏叶中相似。




图1.3银杏内酯的结构^[7]

1.1.4糖类

宋根萍等^[8]对银杏外种皮中的多糖进行了分析,粗多糖得率为6.58%,其中总糖含量为89.7%,还原糖为5.1%,多糖为84.6%。粗多糖水解物中含葡萄糖、果糖、半乳糖及鼠李糖。作者用氧化还原法测定了银杏外种皮中总糖和还原糖的含量,其值分别为85.12%和7.74%。

[8] 宋根萍,许爱华,陈华圣,王小兵. 银杏外种皮多糖的成分分析[J]. 中药材,1997,09:461-463.

1.1.5其他化合物

银杏外种皮含有相当的氨基酸。余碧钰等^[9]测定出银杏外种皮中17种氨基酸的含量为7.115%(银杏果仁为9.041%)。作者测定的结果为3.45%。

银杏外种皮中还含有白果醇( Ginnol) ,棕榈酮(Palmitone) ,三十烷酸( Triacontanoic acid) ,儿茶酚(Pyrocatechol) ,原儿茶酸(Protocatechuic acid) ,白果宁( Ginkgonine) 等。

1.2银杏酸类化合物

银杏酸类化合物,可看作是水杨酸分子在苯环C6位上连有较长侧链的系列化合物,该长链分烷基链和烯基链,一般长链由13一17个碳原子组成,银杏酸是这类化合物的总称

图1.4银杏酸的结构图^[10]

仰榴青^[11]

用RP-HPLC法测得银杏外种皮中银杏酸的含量为5.46%，用LC-ESI-MS鉴定出5种银杏酸成分 （C13∶0，C15∶0-氢化白果酸，C15∶1-白果酸，C17∶1和C17∶2），各成分相对含量分别为20.7%、3.3%、51.6%、21.1%、3.3%，其中C15：1含量最高，其次是C13：0和C17：1，这3种银杏酸占了总银杏酸的90%以上。可见，银杏外种皮中银杏酸含量较高。

1.2.1银杏酸的药理活性研究

抑菌、杀菌作用

杨小明等^[12]通过对银杏酸抑菌能力的研究发现：银杏酸主要变现为对G 菌（兰氏阳性球菌）有较好的抑制作用，而对大肠杆菌没有影响，对金葡菌、枯草杆菌的抑制效果，银杏酸比外种皮粗提取物要好。图1.5银杏外种皮粗提取物和银杏酸的额抑菌活性^[12]

徐立春等^[13]报道银杏外种皮石油醚提取物和乙醇提取物对大部分实验真菌(如铁锈色小孢子菌、迭瓦癣菌和羊毛状小孢子菌等)有抑制生长作用,其抑菌有效率:乙醇提取物为81%,石油醚提取物为73%,克霉唑为74%,0.5%的银杏外种皮中间体抑制真菌效能相当于0.5%的克霉唑。

杀虫作用

王杰等^[14]研究表明有明显抑制活性的成分是银杏酸,用浓度为1.90g·kg- 1的银杏酸组分E饲喂菜青虫,最终校正死亡率可达81.6%,主要作用方式为拒食效应,触杀作用不明显，是否兼有胃毒作用有待进一步验证。余碧钰等^[15]研究表明从银杏外种皮中提取的以银杏酚酸和银杏粉为主要成分的植物性农药40倍稀释液在菜田试验中，菜青虫校正死亡率达75%以上;用此农药喷雾烟草和茄子田进行田间防治试验,桃赤蚜和蛛砂叶螨5 d校正死亡率分别为71.4%和76.4% ,通过研究得出:此植物性农药杀虫机理主要是使害虫拒食,并有毒杀和骨毒作用。

抗肿瘤作用

许素琴^[16]等人研究表明银杏酸单体C17:1对于人体肿瘤细胞,如HCT-15(结肠癌)、MCF-7(乳腺癌)、A-549(肺癌)、HT-1197(膀胱癌)和SKOV-3(卵巢癌),以及

正常结肠细胞(CCD-18-Co)的抑制作用,并且其对正常细胞的毒害作用较弱。

杨晓明^[17]等人研究发现发现银杏酸在低浓度(5μg/ml)时,对正常人肾脏细胞和小鼠NIH/3T3细胞的生长几乎不产生影响,但对人肺癌LTEP-a-2、A549细胞和淋巴瘤U937细胞生长均产生不同强度的抑制作用,其中对LTEP-a-2瘤株的抑制率达59.1%。随着银杏酸浓度的增加,对肿瘤细胞的抑制率增加,但对正常细胞的毒性作用也增强,高浓度银杏酸对正常细胞与肿瘤细胞的杀伤率趋向一致。







除此之外银杏酸还有抗过敏、致过敏以及致突变等作用，在这里我们不对其进行详细描述。

1.2.2银杏酸的理化性质以及光谱性质

理化性质

银杏酸为无色油状或粉末状物质。该类型化合物主要溶于非极性溶剂,溶解性质接近于脂肪酸,难溶于低级醇类,不溶于水,可溶于碱水溶液^[17]。由于银杏酸中含有酚羟基和羧基的存在，故可以判定银杏酸具有酸性，同时也可以判定银杏酸是一种弱电解质。例如Gellerman^[18]就利用其酸性, 经皂化反应将它们从原始萃取物中分离出来, 以便进行下一步分离精制。而在另一些柱分离方法中, 也利用了银杏酸和银杏酚酸性的差异,使用不同酸碱度的洗脱液将它们先后从柱上洗脱下来, 例如Nagabhushana就通过调节洗脱液中醋酸和三乙胺的含量来达到分离银杏酚酸的目的。

光谱性质

银杏酸的紫外吸收光谱图，它有3个特征吸收峰，最大吸收波长分别为220、242和310nm。本试验选择310nm作为检测波长, 其理由有两个:一是虽然242nm左右的吸收峰强度较大, 但易于受到220nm峰的干扰;二是银杏酸分子中的羧基, 在中性流动相中产生部分离解, 因此, 在流动相中加少量冰醋酸, 调节pH值, 以抑制羧基的离解，从而改善色谱峰的分离和峰形, 如果采用242nm作为检测波长, 乙酸在242nm处产生很强的紫外吸收将严重干扰银杏酸的检测, 使检测无法进行。

图1.6银杏酸的紫外光谱^[19]







1.3银杏酸国内外研究现状

1.3.1银杏酸的提取

据对文献的调查，从银杏外种皮中提取银杏酸的方法有很多，常用的提取方法有水提法、有机溶剂提取法、水提一树脂法、超临界C0₂提取法、树脂提取法、酶提取法等。

1. 有机溶剂萃取法

   有机溶剂萃取利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。可以通过银杏酸类化合物极性不同采用不同极性的有机溶剂进行萃取，达到分离银杏酸的目的。常用的提取溶剂主要有石油醚、甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、氯仿等。姚建标等^[20]以银杏酸含量较高的银杏外种皮为原料，通过石油醚回流提取、小孔吸附树脂纯化、中压制备色谱分离，最后以制备液相色谱分离，得到个银杏酸单体。

   严宏凤^[21]研究表明在尽量节约成本的时候，银杏酸（％）的最佳提取工艺为七十摄氏度时候60%乙醇回流两次，每次1.5h可得到银杏酸百分比较高的提取物。

2. 超声萃取法

   超声波提取原理是将超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应应用到中草药成分提取工艺中, 实现击破细胞壁, 高效、快速提取细胞内容物的过程, 提取率较常规方法高。张蓉仙等^[22]分别利用超声萃取制备银杏外种皮石油醚提取物和热水浴回流制取水提取浸膏, 结果表明超声萃取工艺制备粗提物杀灭钉螺效果要好于回流提取方法。

   图1.7白果酸超声萃取工艺流程^[23]

3. 超临界CO₂萃取法

   超临界CO2流体萃取（SFE）是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。

   尹秀莲等^[24]采用超临界CO₂萃取法对银杏外种皮中的银杏酚酸进行了提取，确定了超临界CO₂萃取银杏酚酸的最佳条件，结果表明萃取压力为30MPa,温度45℃ ,萃取时间6h,CO₂流量为2L/min为最佳条件。超临界CO₂萃取法萃取银杏外种皮中的银杏酚酸比传统方法优越,表现在得率、纯度高,无溶剂残留,操作简便。

   图1.8超临界萃取流程图^[25]

   表1.1银杏酚酸各种提取方法的比较

方法	优点	缺点
有机溶剂萃取法	传统方法，操作简单，溶剂廉价，成本较低，适用性广。	提取率低，提取物所含杂质较多，部分溶剂有毒。
超声萃取法	加速植物中有效成分进入溶剂,增加有效成分提取率。比传统的提取方法省时、节能、提取率高[26]。	只能作为辅助手段，不利于大规模生产
超临界CO2萃取法	萃取外种皮中银杏酸操作简便,萃取率和萃取纯度较高,无溶剂残留,环境污染小,优于传统的溶剂萃取法。	仪器复杂，对设备要求较高。

1.3.2银杏酸的分离纯化

（1）硅胶柱层析法

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。因为银杏酸与水杨酸的结构相似、化学性质接近，采用常规的硅胶柱层析法分离得到银杏酸单体比较困难，故使用柱层析方法分离得到总银杏酸产物。

仰榴青等^[27]研究中，在硅胶柱色谱上分离,用石油醚-乙醚-甲酸(89∶ 11∶ 1至

70∶30∶1)洗脱,收集银杏酸组分,浓缩至干,得1次分离纯化产物。重复以上步骤,再用硅胶柱分离纯化一次,得纯银杏酸洗脱液。

优点：分离纯化成都高

缺点：硅胶无法重复使用，纯化成本较高，并且硅胶会吸附一定量的银杏酸，造成银杏外种皮提取物中银杏酸的流失。

1. 大孔树脂吸附法

   大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地通过物理吸附水溶液中的有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。大孔树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。大孔吸附树脂又可分为极性、中极性和非极性三种类型,非极性吸附树脂适宜于从极性溶剂(如水)中吸附非极性物质,极性吸附树脂适宜于从非极性溶剂中吸附极性物质,而中极性吸附树脂则对上述两种情况都具有吸附能力。

   秦俊哲^[28]等人通过使用不同大孔树脂对银杏酸的吸附分离特性研究，其结果表明大孔吸附树脂DA201对银杏酸的吸附为快速平衡型，银杏酸粗提取液上样浓度为 0.45mg/m L，静态吸附时间4h，动态上样流速为1m L/min，银杏酸吸附容量为59.00mg/g，洗脱剂乙醇浓度为95%vol，洗脱速度为1m L/min，解析率为98.46%，银杏酸纯度为83.4%。

   优点：分离纯度高，物理性质稳定，可重复使用。

   缺点：分离效率较低，制备周期较长。

   除此之外还有铅盐沉淀法、碱液萃取法等方法，在此我们不详细进行描述。

   1.3.3银杏酸的分析方法

   紫外分光光度法、高效液相分析法

   （1）紫外分光光度法

   紫外扫描作定性分析，配制不同浓度的标准溶液，选择合适的吸收峰测定吸光度A，以银杏酸浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，线性回归得标准曲线方程。取上述样品溶液在最大吸收波长处测定吸光度，带入标准曲线方程计算银杏酸含量。

   （2）高效液相分析法

   色谱条件: C18(150x4.6mm,5μm ),柱温40℃,流动相为甲醇-3%HAc溶液(90∶10) ,流速1ml/ min ,检测波长310nm ,外标法定量分析。

   图银杏酸的标准液相色谱

2. 研究的基本内容与方案

1. 实验技术及基本方案

   
   

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   3. 研究计划与安排

   第1 ——3周：查阅银杏相关文献资料，明确本课题研究内容，了解银杏外种皮相关成分，掌握银杏酸的提取、分离方法，确定方案，完成开题报告。

   第4 ——5周：银杏酸的粗提及粗提物的分析。

   第6 ——14周：银杏酸的分离纯化及产物的定量和定性分析。

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   4. 参考文献（12篇以上）

   [1] 梁立兴.应大力发展我国的新兴银杏产业[j].中外技术情报,1997（2）：61-65.

   [2] 潘竞先,张虎翼,杨宪斌,洪美芳. 银杏外种皮的双黄酮成分[j]. 植物资源与环境,1995,02:17-21.

   [3] 楼凤昌,王国艳,郭寅龙. 银杏外种皮化学成分研究[j]. 中国药科大学学报,1998,04:76-78.

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