文 献 综 述

1 引言

苯酚及其衍生物是常见的污染物在各种行业的废水中如石化，煤转化和苯酚生产工业（美环保局1987）^[1,2]。苯酚被EPA（Keith and Telliard 1979）列为首要污染物^[3]。因此检测和监测苯酚在水中的存在非常重要。世界各地在共同努力去克服低浓度酚类的检测问题。但却有诸多的缺点，如成本高、净化不完全、产生有毒的副产物等。因此这就要求发展一种成本低、效率高且具有无毒副产物的处理方法。基于酶的生物传感器由于其灵敏度高,用来检测苯酚非常方便有效，然而游离态的酶在检测酚类化合物过程中存在一些缺点，这些缺点限制了游离酶的应用，随着研究的不断推进，固载化的酶得到了广泛的关注。在固定化酶研究中，新型PMO材料由于独特的理化性质，是一种理想的固载材料。因此，本课题主要围绕固载化的酪氨酸酶生物传感器用于检测苯酚，开展制备和性能的一系列研究。

2 苯酚检测

目前已经报道了几种用于检测酚类方法如：比色法^[4]、分光光度计方法、气相色谱分析^[5]、液相色谱分析^[6]和毛细管电泳^[7]等。一般的检测方法耗时且非常昂贵，因此需要简单、灵敏、有效的苯酚检测方法，这也有助于实地监测。酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，存在于动物、植物与微生物体内，而且酶易于提取，活力也较高，可以催化某类苯酚类化合物的氧化,因此近年来国外众多学者对于酪氨酸酶处理含酚废水的研究特别关注。它能利用水中溶解氧，使单酚类化合物羟基化生成邻苯二酚，邻苯二酚脱氢生成醌类化合物，经过一系列非酶聚合过程，形成不溶于水的聚合物，最后通过过滤、沉淀而去除^[7，^8]。然而这类化合物局限在邻位无取代基的苯酚类化合物中^[9] ，酶通常对pH和温度的变化相当敏感，他们可以很容易变性和失活，并且在极端反应条件难以维持其结构和反应性。为了克服这些问题，已经建立在稳定的固体支持物上固定酶的方法。用固载化的酪氨酸酶构建生物传感器可以通过酶在固体上的物理吸附，共价键等几种途径完成，结合到官能化载体上。固载化酶到新材料上是即将要研究的领域。为了实现有效的固定，开发和发现新材料保持酶的活性同时确保其稳定性至关重要。

3 酪氨酸酶的固定化

游离态的酪氨酸酶在检测酚类化合物过程中存在一些缺点，Dincer 等^[10]和Bayramoglu等^[11]分别将酪氨酸酶固定化到壳聚糖黏土复合物和硅材料上进行实验，固定化酶能够有效地防止酶的流失，而且可以重复使用，克服了游离酶的缺点^[12]。所以通过物理或化学的方法将酶固定于载体后不仅能够保留酶原有的活性及高度选择性，而且还会提高酶处理效率、延长酶的使用寿命和降低处理成本。

在固定化酶研究中，各种各样的材料被作为固定化载体应用到固定化酶研究中去，例如溶胶#8212;凝胶材料^[13]、有机聚合物材料^[14]和无机孔材料^[15]等。在这些固定化载体中，介孔二氧化硅具有较高的比表面积、有序的孔结构、均一的孔径、基于修饰的外表面及良好的热稳定性、机械稳定性和较低的毒性，这些独特的优势使得二氧化硅成为最具潜力的酶固定化载体^[16]。Hartmann小组^[17]利用多种有机硅源制备了具有笼状孔结构的系列介孔有机氧化硅材料，并以该系列材料为载体进行脂肪酶的固定化研究。由于有机氧化硅具有独特的孔结构及较高疏水性，该系列材料体现了较高的蛋白担载量，同时固定化酶的活力最高可达 500%（相比于裸酶）。在以二氧化硅为载体的固定化过程中，可通过物理吸附法、共价连接法和包埋法三种方法将酶分子固定到固体载体中。物理吸附法是最常用也是最简单的酶的固定方法，一般是将酶溶液与有序介孔材料（有序介孔材料作为载体）相接触，使酶吸附到它的上面。它主要是凭借着酶和载体之间的氢键、静电吸引力和范德华力。共价连接法稍微严格一点。它有一个要求：载体表面上有乙烯基、环氧基和氨丙基等有机基团，这些有机基团在温和的反应条件下能与酶产生一定的结合力。包埋法就是先把酶分子吸附至有序介孔材料内部，然后通过改变介孔材料的孔口尺寸，使其小于酶分子的直径，从而可以将酶包埋在有序介孔材料的内部。虽然它可以有效地避免酶分子从孔内部流出的现象，但由于硅烷化反应的条件太剧烈，会导致酶失去活性，从而使得固定化效果不佳。

4 PMO材料

有序介孔有机硅材料（PMO）由于孔壁中均匀的有机基团分布和独特的表面性质而在材料领域备受关注。不同于有机功能化的介孔硅材料，PMO结构中的有机基团的引入是利用有机硅的水解和缩聚反应直接将有机组分嵌入到孔壁中，而非后功能化或嫁接等方式。PMO是一类独特的有序介孔的材料（2-30nm)，其中每个单独的有机基团共价键合到两个或多个硅原子上，因为它具有硅和有机基团的双重性质而受到了广泛的关注。PMO材料具有高比表面、大的孔体积、可变的介孔孔道、有序的孔径大小分布、可控的孔壁组成和易修饰的表面性质等优点。另外，与非PMO的介孔硅材料相比，PMO具有良好的水热稳定性和机械稳定性。因此，利用精心设计的桥联型有机硅前驱体制备的PMO材料，具有广泛的应用，一、是催化剂的优良载体，杂多酸、胺类、金属氧化物和过渡金属络合物等催化剂都可以通过材料的表面改性负载到介孔孔道中；二、是一种理想的吸附材料, 在吸附分离中有着广泛的用途；三、介孔材料可以来制备传感器材料用于酶，氨基酸等生物小分子的固载。例如用介孔MCM分子筛系列固定蛋白质酶， 不仅保持了酶得活性提高了负载量, 而且这些酶分子能够在介孔内自由扩散。PMO材料相比于MPS的合成过程, 区别在于硅源的不同, PMO材料在合成过程中一般采用有机硅源。自从有了PMO材料,介孔氧化硅在实际中的应用前景又得到了进一步的拓展。

4.1 PMO材料的合成

PMO的合成体系由表面活性剂即结构导向剂、酸或者碱、有机桥联型倍半硅氧烷前驱体、溶剂，无机硅源组成,通过水热合成法合成该材料^[18-20]。主要步骤:(1)将模板剂、酸或碱、去离子水混合, 在室温环境下搅拌, 加入模板剂与前躯体在一定条件下水解、缩聚自组装合成具有纳米尺寸的液晶相（2）水热反应完成后在高压反应釜中晶化（3）利用萃取的方法脱模板剂，使材料中间成孔状, 前躯体通过共缩聚形成介孔孔壁。其中，PMO的合成体系中最经常用的结构导向剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）、十六烷基三甲基溴化铵或氯化铵(CTAB/CTAC)或十八烷基三甲基溴化铵或氯化铵(OTAB/OTAC)，他们在一定条件下（合适的温度、浓度、PH)和加入的有机硅源协同自组装，形成具有有机基团做硅原子之间桥梁的有序结构。PMO的合成路线如下：