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摘 要

目的：本论文建立了对复方硝酸咪康唑可的松软膏中硝酸咪康唑和氢化可的松含量的测定方法，利用高效液相色谱法进行含量测定方法的研究和方法学考察。方法：色谱柱为Venusil XBP C18柱（250×4.6mm，5um），流动相A:0.01mol/L的磷酸二氢胺溶液（用稀氨水调PH为6.0）和流动相B:乙腈，柱温为30℃，进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，进样量为20µl，检测波长为235nm。 结果：硝酸咪康唑在0.025mg/ml-1mg/ml范围内与峰面积比之间呈良好的线性关系，其线性方程为：y = 247295x 1640.5 r＝0.9996。硝酸咪康唑（浓度为0.25mg/ml）溶液在8h 稳定，相对标准偏差(RSD)%为1.4%（n=6）；精密度良好，RSD为0.95%(n=4)。氢化可的松在0.0125mg/ml-0.5mg/ml范围内与峰面积比之间呈良好的线性关系，其线性方程为：y = 443636x 2440.7 r＝0.9991。氢化可的松（浓度为0.125mg/ml）溶液在8h 稳定，相对标准偏差(RSD)%为1.5%（n=6）；精密度良好，RSD为0.95%(n=4)。结论：该分析方法简便、准确、可靠，适用于复方硝酸咪康唑可的松软膏中硝酸咪康唑和可的松的含量测定。

【关键词】 ：高效液相色谱法 复方硝酸咪康唑可的松软膏 含量测定

Content Determination of Miconazole nitrate and Hydrocortisone in Miconazole and Hydrocortisone Cream

Abstract

Objective : This paper established a method for content determination of Miconazole nitrate and Hydrocortisone in Miconazole and Hydrocortisone Cream, by high performance liquid chromatography method for determination of the research and methodological study. Methods : Chromatographic separation was performed on an Venusil XBP C18 column (250 × 4.6mm，5um), the mobile phase consisted of 0.01mol/L ammonium dihydrogen phosphate and acetonitrile with a gradient elution at a flow rate of 1.5 mL/ min. The UV detection was performed at a wavelength of 235 nm. the temperature of the column was 30 ℃, injection volume was 20ul.

Rerults: The linear calibration curves were obtained in the concentration range of 0.025-1mg/ml with the regression equation: y = 247295x 1640.5 r = 0.9996. paeoniflorin was stable at 8 hours and RSD was 1.4%. The linear calibration curves were obtained in the concentration range of 0.0125-0.5mg/ml with the regression equation: y = 443636x 2440.7 r = 0.9991. paeoniflorin was stable at 8 hours and RSD was 1.5%. Conclusion : This method is simple , accurate and effective for content determination and it is suitable for the content determination of Miconazole nitrate and Hydrocortisone in Miconazole and Hydrocortisone Cream.

Key words: HPLC Miconazole and Hydrocortisone Cream Content determination

目 录

摘 要 I

第一章 复方硝酸咪康唑可的松软膏的综述 1

1.1 复方硝酸咪康唑可的松软膏 1

1.1.1 主要活性成分基本信息 1

1.1.2作用机制 2

1.1.3 临床应用 2

1.1.4 含量测定 3

1.2 研究依据与目的 4

第二章 复方硝酸咪康唑可的松软膏含量测定 5

2.1 仪器与试剂 5

2.1.1 仪器 5

2.1.2 试剂 5

2.1.3 供试品与对照品 5

2.2 测定方法 6

2.2.1 溶液的配制 6

2.2.2 色谱条件 6

2.3 方法学研究 7

2.3.1系统适用性试验 7

2.3.2 线性关系研究 8

2.3.3 精密度实验 11

2.3.4 稳定性实验 13

2.3.5 重复性实验 14

2.3.6回收率实验 18

2.3.7 含量测定实验 19

2.4 小结 21

第三章 结论与展望 22

3.1 结论 22

3.2 展望 22

致 谢 26

第一章 复方硝酸咪康唑可的松软膏的综述

1.1 复方硝酸咪康唑可的松软膏

复方硝酸咪康唑可的松软膏（Miconazole and Hydrocortisone Cream）是一种光谱抗真菌药物，对于许多临床致病真菌如球孢子菌、白色念球菌、芽生菌等深部真菌、酵母菌等表皮真菌以及链球菌和葡萄糖球菌等革兰氏阳性菌均有抑制作用。临床上主要用于发炎性皮肤病的局部治疗。

复方硝酸咪康唑可的松软膏中的主要活性成分是硝酸咪康唑和氢化可的松。硝酸咪康唑是一类咪唑类光谱抗真菌药，氢化可的松是甾体类抗炎药，两者复合使用，在抗菌的同时能加快炎症的消退，相对于单方抗真菌类药有一定的优势。

1.1.1 主要活性成分基本信息

名称：硝酸咪康唑 英文名：Miconazole Nitrate

化学式：

分子式：C₁₈H₁₅C_l4N₃O₄ 分子量：479.15

硝酸咪康唑为白色或类白色的结晶或结晶性粉末；无臭或几乎无臭。在甲醇中略溶，在氯仿或乙醇中微溶，在水或乙醚中不溶。熔点为178～184℃。

名称：氢化可的松 英文名：Hydrocortisone

化学式：

分子式：C₂₁H₃₀O₅ 分子量：362.46

氢化可的松是白色或几乎白色结晶性粉末；无臭。遇光易变质。不溶于水。

1.1.2作用机制

硝酸咪康唑的抗菌机制主要是通过干扰细胞色素P-450的活性，以抑制真菌细胞膜主要固醇类-麦角固醇的生物合成，破坏其细胞膜使其通透性改变，导致细胞内的重要物质渗出，杀死细菌。硝酸咪康唑还能抑制真菌的磷脂和三酰甘油的合成，使氧化酶和过氧化酶的活性受到抑制，由于细胞内酶的积聚引起细胞亚微结构变性，使细胞坏死。

氢化可的松是一种糖皮质激素类药，这类药物对化学性、物理性、感染性、免疫性或无菌性反应等引起的炎症包括其病理发展过程的不同阶段均有显著性的非特异性抑制作用。在 炎症初期，药物可以增加毛细血管通透性，使渗出和水肿减轻；抑制炎症介质的产生和释放，使红、肿、热、痛等现象得到改善；在转录水平上直接抑制粘附离子（粘连素，E-选择素）的表达；抑制NO合酶的活性，从而阻断NO等相关介质的产生。在炎症后期，药物能抑制抑制毛细血管和成纤维细胞的增生，通过延缓粘多糖和胶原蛋白的合成以抑制肉芽组织的增生，防止组织粘连和瘢痕形成，减轻后遗症。

1.1.3 临床应用

复方硝酸咪康唑可的松软膏在临床上主要用于发炎性皮肤的局部治疗，如皮肤擦烂和感染湿疹；潮湿或干燥性湿疹（皮炎），包括特异性皮炎、接触刺激物或变应原导致的皮炎或脂溢性皮炎，如痤疮及相关疾病；肛周及外阴皮炎。由于软膏中的主要活性成分是广谱类抗真菌药和消炎药，所以复方硝酸咪康唑可的松软膏对于由各种真菌引起的感染和炎症都有一定的疗效。

硝酸咪康唑在临床上常制成单方硝酸咪康唑软膏、霜或者散剂用于浅部真菌病的治疗，如湿疹^[7]、真菌性外耳道炎^[8]、体骨癣^{[10] [11]}、足癣^[12]、尿布接触性皮炎^[13]等。由于硝酸咪康唑对假丝酵母菌、白色念球菌、霉菌引起的外阴阴道感染有较好的治疗疗效，所以也被制成栓剂和软胶囊剂，临床上被广泛用于治疗常见的外阴阴道炎症。

氢化可的松在临床上被广泛用于皮肤炎症疾病的治疗，包括萎缩性和婴儿湿疹，接触性皮炎和擦烂性湿疹。

1.1.4 含量测定

目前关于硝酸咪康唑软膏中的硝酸咪康唑的含量测定的研究有很多，但是关于硝酸咪康唑和氢化可的松复方的药物的含量的测定的研究较少。曹文冰等采用高效液相色谱法对复方硝酸咪康唑乳膏中的硝酸咪康唑和氢化可的松的含量进行了测定。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠（用磷酸调节PH值为2.3）（65:35）；流速：1.0mol/min；柱温：23℃；进样量：10μl；检测波长：230nm。测定结果中，硝酸咪康唑的平均回收率为101.0%，RSD为0.58%，氢化可的松的平均回收率为99.96%，RSD为0.71%，测得的硝酸咪康唑和氢化可的松的含量均在90～110%范围内。

中山大学药学院和南方医科大学（李全文）采用毛细管电泳法对西安杨森制药有限公司生产的硝酸咪康唑软膏和硝酸咪康唑阴道栓中的硝酸咪康唑分别进行了含量测定。测定条件：选择3.0mmol/L乳液 10%乙醇缓冲液为电泳介质，分离电压为20.0KV。试验方法：毛细管在使用前，分别用0.1mm0l/LNaOH溶液和水各冲洗10min，再用缓冲液洗20min，每次测定后，用运行缓冲溶液洗2min，以确保较好的重现性，用重力虹吸方式进样，进样高度为25.0cm，进样时间为15.0s。实验条件：恒温（25℃）恒湿(60%)。实验结果测得两组制剂中的硝酸咪康唑的回收率分别为94.9～101%和95.3～99.1%。

天津市长征医院的王梓等采用紫外分光光度法对硝酸咪康唑霜中的硝酸咪康唑含量进行了测定，实验中选择280nm处测定样品中硝酸咪康唑含量可消除基质的干扰，发现硝酸咪康唑在0.1～0.7mg/ml浓度范围内，波长280nm处，溶液浓度与吸收度呈良好线性关系。

陈笑天等采用高效液相色谱法对尿素氢化可的松乳膏中的氢化可的松的含量进行了测定。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水（50:50）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：245nm。结果测得3批样品中氢化可的松的平均标示百分含量分别为97.5%（RSD=1.72%）、98.2%（RSD=0.93%）、96.8%（RSD=1.57%），试验中发现在甲醇-水（50:50）条件下组分峰分离度良好，色谱峰型对称，可达到满意的分离效果。

以上几种测定方法，高效液相色谱法对硝酸咪康唑和氢化可的松的含量测定研究颇多。在本实验中建立高效液相色谱法对复方硝酸咪康唑可的松软膏中硝酸咪康唑和氢化可的松含量测定，使得2个化学组分能在同一色谱系统条件下进行含量检测。色谱条件 ：流动相A:0.01mol/L的磷酸二氢胺溶液（用稀氨水调PH为6.0）和流动相B:乙腈，柱温为30℃，进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，进样量为20µl，检测波长为235nm。

1.2 研究依据与目的

复方硝酸咪康唑可的松软膏以其主要活性成分硝酸咪康唑和氢化可的松的含量作为其质量标准。本课题用硝酸咪康唑和氢化可的松作为外标物，建立适当的检测方法，来检测复方硝酸咪康唑可的松软膏中硝酸咪康唑和氢化可的松的含量，为将来进行药物安全性评价提供基础。

本实验中采用高效液相色谱法来测定硝酸咪康唑和氢化可的松的含量，是由于高效液相色谱法分辨率高于其它色谱法；速度快，进样量少，十几分钟到几十分钟可完成；重复性高；高效相色谱柱可反复使用；自动化操作，分析精确度高。同时，采用外标法计算。外标法是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。

第二章 复方硝酸咪康唑可的松软膏含量测定

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪、2996PDA检测器、

Ssrtorious BS124S型天平 生产厂家：赛多利斯科学仪器有限公司

KQ-700DE数控超声波清洗器 生产厂家：昆山超声仪器有限公司

2.1.2 试剂

乙腈 TEDIA公司 批号：AS1122-801

甲醇 国药集团化学试剂有限公司 批号：12120312081

超纯水 实验室超纯水机

2.1.3 供试品与对照品

供试品名称：硝酸咪康唑可的松软膏

批号：130301

规格：15g/支

包装：铝管

保存条件：阴凉处

对照品名称：硝酸咪康唑，

批号：100213-200705

来源：中国药品生物制品检定所

含量：99.7%

对照品名称：氢化可的松

来源：中国药品生物制品检定所

含量：99.7%

2.2 测定方法

本品硝酸咪康唑和氢化可的松的测定采用高效液相色谱法。

2.2.1 溶液的配制

对照品的配制：取硝酸咪康唑对照品25mg，氢化可的松对照品12.5mg，甲醇40ml超声波10min，加水稀释定容至50ml。

供试品的配制：取复方硝酸咪康唑可的松软膏适量（约含硝酸咪康唑25mg，氢化可的松12.5mg），精密称定，加甲醇40ml溶解，超声10min，然后加水稀释定容至50ml,-20℃冷冻1小时，3000rpm离心10min，滤过，精密量取20μl。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18 柱（4.6×150,5µm）

流动相：A: 0.01mol/L的磷酸二氢铵溶液 B:乙腈

柱温20℃，

检测波长235nm，

流速1ml/min，

进样量20µl

2.3 方法学研究

2.3.1系统适用性试验

精密吸取空白溶液及供试品溶液20µl，在实验所用的色谱条件下进样测定。结果表明，供试品中硝酸咪康唑，氢化可的松成分得到较好的分离，其色谱峰的分别保留时间在5.50min，19.05min，且峰形良好。在本实验条件下，按复方硝酸咪康唑可的松计算；样品中硝酸咪康唑，氢化可的松与其他组分分离符合要求。如图

图1： 硝酸咪康唑可的松空白品液相色谱图

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