论文总字数：17594字

摘 要

人参是名贵的中药材。人参皂苷是人参的主要有效成分,对于肿瘤、炎症、细胞氧化和细胞凋亡等都具有很好的药理活性。然而，在自然界中，人参皂苷的含量相当低。医药及研发等方面对人参皂苷的需求量日益增长，但珍稀资源的紧缺导致供不应求。本研究旨在通过人工方法提高人参皂苷的产量，弥补自然界含量少的不足。实验拟采用非水相酶法催化原人参苷元糖基化，以实现人参皂苷的高效制备。本工作作为非水相酶法制备人参皂苷的第二阶段研究任务，对前一阶段研究得到的产糖基转移酶的耐有机溶剂菌株进行鉴定，并对其进行克隆与表达方面的研究与探讨，为非水相酶法催化人参皂苷的生物转化完成了第二阶段的前期工作。本实验首先采用16S rDNA序列测定法对菌株进行鉴定，按照鉴定结果，用NCBI数据库查找相关的基因组信息，设计引物扩增糖基转移酶基因，并构建合适的表达载体来将其导入到大肠杆菌中，通过调节诱导条件实现该糖基转移酶在大肠杆菌中的异源表达，为将其应用于达玛烷型三萜皂苷的生物转化提供一定的技术支持。

关键词：人参皂苷 糖基转移酶 菌株鉴定 克隆和表达

Bioconversion of dammarane-type triterpenoid saponins

——Cloning and expression of glycosyltransferase

Abstract

Ginseng is a precious Chinese herbal medicines.Ginseng saponin is the main active ingredient of ginseng, and it has good anti-tumor, anti-inflammatory, antioxidant and inhibition of apoptosis pharmacological activity.However, ginsenosides in ginseng and American ginseng are in the lower levels,and limited natural resources can not meet the growing demand for pharmaceutical research and development.This study useing a non-aqueous phase enzymatic catalyzes raw ginseng aglycone to glycosylation, in order to implement the controlled and efficient preparation of ginsenosides. As the second phase of the research on the preparation of ginsenoside by non-aqueous enzymatic method,this work aims to identify the organic solvent resistant glycosidase strains from the last phase,and research and investigate the he cloning and expression of the enzyme.It completes the second phase of the preparatory work of a non-aqueous phase Enzymatic biotransformation of ginsenosides.This study identifies the strains by its 16S rDNA sequences.And find relevant genomic information from the NCBI database based on the results.Design appropriate primers to amplify the desired glycosyltransferase gene and construct an appropriate expression vector to be introduced into E. coli.Achieve the high expression of glycosyltransferase heterologousthe in E. Coli by adjusting the conditions.Preliminary Studies on the properties of the glycosyltransferase is aimed to apply it to dammarane saponin biotransformation.

Keywords:Ginsenoside; Glycosyltransferase; Strain identification; Cloning and Expression;

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1人参皂苷简介 1

1.2人参皂苷制备的现状 2

1.2.1化学转化法 2

1.2.2微生物转化法 2

1.2.3酶法转换法 2

1.3非水相酶催化体系 2

1.4本课题研究目的与意义 3

第二章 耐有机糖基转移酶产生菌的鉴定和克隆 4

2.1实验材料 4

2.1.1实验仪器 4

2.1.2实验试剂 4

2.2实验方法 5

2.2.1鉴定原理 5

2.2.2培养基 5

2.2.3产糖基转移酶明胶芽孢杆菌的菌种鉴定 6

2.2.4明胶芽孢杆菌糖基转移酶基因的扩增 10

2.2.5 明胶芽孢杆菌糖基转移酶基因克隆载体的构建 11

2.3结果和分析 12

2.3.1产糖基转移酶明胶芽孢杆菌的菌种鉴定 12

2.3.2明胶芽孢杆菌糖基转移酶基因的扩增 12

第三章 明胶芽孢杆菌糖基转移酶基因的表达和诱导表达 14

3.1明胶芽孢杆菌糖基转移酶基因的表达 14

3.1.1表达引物的设计 14

3.1.2表达载体的构建 14

3.1.3表达载体的转化 15

3.1.4测序 15

3.2糖基转移酶BG-GT基因在大肠杆菌内的诱导表达 15

3.3结果与分析 16

3.3.1 BG-GT基因表达载体的构建 16

3.3.2 BG-GT基因在大肠杆菌内的表达 17

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致 谢 22

文献综述

人参，是一种珍贵的五加科孑遗植物,更是极其珍贵的中药材, 它的应用历史可以追溯到几千年以前。在很多我国乃至世界草本专著里面，人参都无一例外的被列为上等品。 人参, 味甘甜，性微寒。主要滋补五脏, 能安抚精神, 平定魂魄, 抑止惊慌悸热, 避除邪阴之气, 明目, 开心益智。久服, 轻身延年^【1】。”

多年以来，药理学人士对人参的研究, 证实了一种称为“人参皂苷”的物质人参里面主要发挥药效。按常规分类，人参皂苷目前被分为两种类型,分别是齐墩果烷型和达玛烷型，此种分类的依据是苷元基本骨架的不同。它们都称为三萜类化合物^【2-3】。人参皂苷的药用价值除了我们熟知的滋补身体的功效外，其余是我们非专业研究人员难以想象和预测的---抗炎、抗肿瘤、抗细胞氧化和抑制细胞凋亡以及其他未知等等^【4】。近些年来，相关领域专家学者对人参皂苷极为关注，研究讨论不断^[5]。

1.1人参皂苷简介

作为人参中最珍贵的成分，人参皂苷的量也仅仅占到4%左右，足以见得它的含量究竟是多么的微乎其微^【6】。人参皂苷属于三萜皂苷,它的基本结构中包含苷元和糖糖基，并且二者相连形成糖

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