论文总字数：18997字

摘 要

青霉素酰化酶能够很好的催化酰化/去酰化反应，由于其此特性，使其在医药工业中具有非常重要的作用，其在医药工业中的作用主要是半合成青霉素和头孢菌素，青霉素酰化酶还能催化合成具有更高活性，更宽抗菌谱，适用于各种用途的新型β-内酰胺类抗生素。虽然青霉素酰化酶的研究已经发展了很多年，并且取得了许多重要成果，但基础性的研究还不够深入，能够适用于工业大规模生产的性质优良的酶依旧缺乏，因而筛选性质更加优良的青霉素酰化酶具有广阔的发展潜力。

本文利用实验室前期已经构建的His标签表达载体，经诱导表达，采用Ni 柱分离纯化蛋白，获得了青霉素酰化酶PGApx02纯酶。本文主要研究了PGApx02纯酶的最适温度，温度稳定性，最适pH，pH稳定性以及有机溶剂耐受性。经研究发现，其有良好的热稳定性，其对乙二醇、聚乙二醇、丙三醇等有机溶剂具有较好的耐受性。基于本实验室前期对其催化合成阿莫西林的研究，本文对其催化合成头孢羟氨苄进行了初步研究。

关键词：半合成抗生素 青霉素酰化酶 热稳定性 pH稳定性 有机溶剂耐受性

key enzymes’ properties of synthesizing antibiotic

Abstract

Penicillin acylase plays an important role in pharmaceutical industry, due to its catalytic acylation/deacylaction characteristics. It’s mainly used in production of novel semi-synthetic penicillins and cephalosporins, which have a series of advantages, such as highly efficient , board-spectrum and suitable for different uses.Although the study on penicillin acylase has been carried out for many years and made important progress, it’s still lack of deep basic research and excellent enzymes

in large-scale industrial production,so screening more good properties of penicillin acylase have broad development prospects.

Before this paper,His-tags expression vector has been constructed,after induced and expressed ,then using Ni Sepharose Performance technology for the separation and purification of protein and it help us get the pure penicillin acylase.We studied the thermal stability,organic tolerability,pH stability of the pure enzyme then we found that it have good thermal stability and it have good tolerance to ethylene glycol, polyethylene glycol and glycerol.Based on the previous research PGApx02’s catalytic activity on Amoxicillin of our laboratory，this paper rudimentary studied the PGApx02’s catalytic activity of Cefadroxil.

Keywords:penicillin acylase;semi-synthetic penicillins;thermal stability;organic tolerability;pH stability

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1青霉素酰化酶研究概况 1

1.1.1青霉素酰化酶的来源及分类 1

1.1.2青霉素酰化酶的结构及催化机理 1

1.2青霉素酰化酶的纯化 2

1.3青霉素酰化酶的酶学性质 2

1.3.1青霉素酰化酶的最适温度和温度稳定性 2

1.3.2青霉素酰化酶的最适pH值和pH稳定性 3

1.3.3青霉素酰化酶的有机溶剂耐受性 3

1.4青霉素酰化酶的应用 4

1.4.1在半合成抗生素中间体制备中的应用 4

1.4.2在半合成β-内酰胺类抗生素中的应用 4

1.4.3在对映体拆分中的应用 5

1.4.4在多肽合成中的应用 6

1.5本课题研究的内容及意义 6

1.5.1研究内容 6

1.5.2研究意义 6

第二章 青霉素酰化酶性质的研究 8

2.1实验材料 8

2.1.1实验试剂 8

2.1.2实验仪器 9

2.1.3培养基 10

2.2实验方法 10

2.2.1利用Ni柱分离纯化蛋白 10

2.2.2青霉素酰化酶PGApx02酶活的测定 10

2.2.3青霉素酰化酶PGApx02的最适pH 12

2.2.4青霉素酰化酶PGApx02的pH稳定性实验 13

2.2.5青霉素酰化酶PGApx02的最适反应温度 13

2.2.6青霉素酰化酶PGApx02的温度稳定性 13

2.2.7青霉素酰化酶PGApx02的有机溶剂耐受性 13

2.2.8青霉素酰化酶PGApx02在非水相体系中催化合成头孢羟氨苄的初步研究 13

2.3结果与讨论 14

2.3.1青霉素酰化酶PGApx02的纯化 14

2.3.2青霉素酰化酶PGApx02的最适pH 14

2.3.3青霉素酰化酶PGApx02的pH稳定性 15

2.3.3重组青霉素酰化酶PGApx02的最适反应温度 16

2.3.4青霉素酰化酶PGApx02的温度稳定性 16

2.3.5重组青霉素酰化酶PGApx02的有机溶剂耐受性 17

2.3.6青霉素酰化酶PGApx02在非水相体系中催化合成头孢羟氨苄的的初步研究 18

2.4本章小结 18

第三章 结论和展望 20

3.1结论 20

3.2展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1青霉素酰化酶研究概况

1.1.1青霉素酰化酶的来源及分类

青霉素酰化酶最早是在米曲霉和黄青霉Q176(Penicillium shrysogenum)中发现^[1]，最近研究发现其存在于多种放线菌，细菌，真菌，酵母菌等细菌中^[2]。但该酶主要存在于杆菌和单孢菌中，如^[3]：粘性节杆菌^[4]，大肠杆菌^[5]，浑浊醋杆菌^[6]，巴氏醋酸杆菌^[7]，假单胞菌^[8]，巨大芽孢杆菌^[9]，无色杆菌^[10]，产黑假单胞菌^[11]，醋酸杆菌^[12]，坏死单孢菌^[13]等。不同种类的细菌产生的青霉素酰化酶，都能催化相同的反应，但不同种类的细菌产生的青霉素酰化酶存在明显的底物选择性，而且其催化中心也存在显著差异。根据青霉素酰化酶所催化的反应的底物的优先度差异，青霉素酰化酶可分为三大主要类别：青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶、苄基青霉素酰化酶^[14]。其催化底物及底物结构式如表1-1：

表1-1 青霉素酰化酶的分类

1.1.2青霉素酰化酶的结构及催化机理

青霉素酰化酶包含α、β两个亚基。其前体蛋白没有活性，由信号肽，α亚基，连接肽和β亚基组成，通过蛋白质剪切，切除信号肽和连接肽，然后α亚基和β亚基通过氢键连接，形成有活性的青霉素酰化酶，分离的α亚基或β亚基均不显示催化活性，要显示催化活性要求两个亚基必须以正确的方式连接^[15]。抗生素结合位点存在于α亚基，因此α亚基决定底物的专一性，α亚基的大小为20-23kDa；N端为β亚基的活性中心，活性中心包含催化位点和与催化有关的基团^[16]。

请支付后下载全文，论文总字数：18997字