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摘 要

Baeyer-Villiger反应是一种重要的化学反应，能够生成许多中间体用于生产化学产品和药物。Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）与传统酶相比，有较好的选择性、可控性、经济型，能够催化Baeyer-Villiger单加氧反应合成许多有价值的化学产物。单加氧酶的运用拥有巨大的市场潜力，它可以作为手性化合物合成反应过程中的催化剂，在目标分子特定位置加氧原子。然而当下还存在着许多问题，比如单加氧酶做为催化剂的热稳定性、辅酶因子再生等。本课题以环己酮和苯甲硫醚为模式底物，对土壤中来源的6种不同微生物进行氧化酶活性的筛选。以期得到能够催化该底物的单加氧酶，后期对酶的结构进行分子改造，提高催化性能。

关键词：Baeyer-Villiger单加氧酶 基因技术 资源挖掘 分子改造

ABSTRACT

The Baeyer-Villiger reaction is an important chemical reaction that generates many intermediates for the production of chemical products and drugs. Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) has better selectivity, controllability, and economy than traditional enzymes, and can catalyze the Baeyer-Villiger monooxygenation reaction to synthesize many valuable chemical products. The application of monooxygenase has great market potential. It can be used as a catalyst in the synthesis reaction of chiral compounds, adding oxygen atoms at specific positions in the target molecule. However, there are still many problems at the moment, such as the thermal stability of monooxygenase as a catalyst, the regeneration of cofactors, and the like. In this project, cyclohexanone and thioanisole were used as model substrates to screen the oxidase activities of six different microorganisms in soil. In order to obtain a monooxygenase capable of catalyzing the substrate, the structure of the enzyme is molecularly modified later to improve the catalytic performance.

Keywords: Baeyer-Villiger monooxygenase;Gene technology;Resource mining; Molecular transformation

目 录

摘要.......................................................................................................................................................................................................................................................................................I

ABSTACT.......................................................................................................................................................................................................................................................................II

目录...................................................................................................................................................................................................................................................................................III

第一章 文献综述 1

1.1生物催化 1

1.1.1定义 1

1.1.2生物催化剂 1

1.1.3概要 1

1.1.4应用前景 2

1.1.5展望 2

1.2菌种筛选 3

1.2.1定义 3

1.2.2过程 3

1.3Baeyer-Villiger催化氧化反应 3

1.3.1介绍 3

1.3.2特点 4

1.3.3Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）的介绍 4

1.4苯丙酮单加氧酶（PAMO）催化的Baeyer-Villiger反应 5

1.4.1 PAMO的介绍 5

1.4.2 PAMO的结构特点 5

1.4.3 PAMO催化的Baeyer-Villiger反应 5

1.4.4 PAMO的应用 5

1.5分子改造 6

1.5.1加氧酶的改造 6

1.5.2定点突变技术 6

第二章 实验材料与设备 8

2.1 实验主要仪器 8

2.2实验主要试剂 9

2.3 实验用菌株、质粒 9

第三章 实验方法 10

（一）资源挖掘及筛选 10

3.1生长细胞的筛选 10

3.2静息细胞的筛选 10

（二）分子改造 11

3.3PCR反应 11

3.4化学转化 13

3.5挑单菌落 13

3.6甘油保藏 13

3.7送测序 13

3.8测试Baeyer-Villiger反应活性 13

第四章 结果与分析 15

4.1单加氧酶的资源挖掘 15

4.1.1 以环己酮为底物的筛选 15

4.1.2 以苯甲硫醚为底物的筛选 15

4.1.3总结 17

4.2PAMO分子改造 18

4.2.1琼脂糖凝胶电泳结果与分析 18

4.2.2气相分析PAMO反应活性 18

4.2.3总结 21

第五章 结论与展望 22

参考文献 23

致谢 26

第一章 文献综述

1.1生物催化

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