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摘 要

透皮给药具有诸多优点受到研究者的青睐，但是由于皮肤阻碍了药物的吸收，使得药物治疗效果差，因此本文自主设计了一种具有优良透皮效果的传递体，首先利用薄膜分散发制备传递体，然后对其脂质体电位、粒径和包封率进行研究实验表明粒径大小为71nm，细胞穿膜肽修饰后电位由-39翻转为 21，证明细胞穿膜肽已经修饰在传递体表面，包封率为99%，证明此传递体性质优良，然后对及体外透皮效率和皮肤沉积量进行研究，实验表明穿膜肽修饰的传递体透皮率最高皮肤沉积量最多，证明该制剂为一种优良的透皮给药制剂。

关键词：透皮给药 传递体 细胞穿膜肽

目 录

摘 要 I

ABSTRACT I

第一章 文献综述 1

1.1脂质体概述 1

1.1.1脂质体简介、分类及制备方法 1

1.1.2 脂质体的质量控制 2

1.1.3脂质体的特点及给药途径 3

1.1.4脂质体在药学上的应用 3

1.1.5透皮给药 4

1.2黑色素瘤概述 4

1.2.1黑色素瘤的定义 4

1.2.2黑色素瘤的病因 4

1.2.3黑色素瘤的治疗方法 5

1.3研究工作 6

第二章 制备及透皮性能考察 8

2.1前言 8

2.2实验材料 8

2.2.1实验试剂 8

2.2.2实验仪器 9

2.3实验方法 9

2.3.1脂质体的制备 9

2.3.2脂质体粒径、电位及包封率 10

2.3.3荧光性能检测及标准曲线制定 10

2.3.4脂质体体外透皮效率试验 11

2.3.5体外皮肤沉积实验共聚焦显微镜 12

2.4实验结果 12

2.4.2香豆素6的标准曲线 13

2.4.3透皮性能 13

2.4.4皮肤沉积共聚焦 14

2.5小结 15

第三章 展望 16

3.1展望 16

参考文献 17

第一章 文献综述

1.1脂质体概述

1.1.1脂质体简介、分类及制备方法

当处在潮湿环境例如在液体水中时，当磷脂分子的某个部位亲水头伸入水面下，从而让脂质体的疏水部位疏水尾接触到空气中并进行混匀动作，球形脂质体就产生了并有特殊结构双脂肪分子。脂质体是一种人工膜。脂质体有多种用途例如基因修改和制备药物。上个世纪70年代以来，药物载体的研究的大幕逐渐被拉开，其代表人物为Gregoirfdson和 Rymen ，他们创新的使用新的药物载体即脂质体来做课题。随着现代科技的不断发展，脂质体的作用机制越来越被探究清晰，其作为药物载体的用途也得到世界的关注。脂质体可以降低药物毒性和耐药性，增加药物疗效和药物活性基团。在现代脂质体的应用越来越广泛，相应的对脂质体的需求的多样和专一性也越来越多。比图可以通过分类进入细胞速度的不同改变进入细胞的方式；提高和靶细胞作用的效率实现效果的不同。但是对于作为药物载体的脂质体，我们需要着重研究脂质体的细胞作用的因子从而实现高效安全的目的。脂质体由脂质（磷脂）和添加剂组成。1、磷脂：包括天然磷脂和合成磷脂两种。因为有了亲水基团其中有磷酸基团和季铵基团，以及亲脂性基团其中有两个不短的羟基构成。卵黄和大豆可以演变成卵磷脂其中有磷脂铣胆碱和PC，而卵磷脂是天然磷脂的主要构成成分。氢化磷脂酰胆碱是一种稳定性好抗氧化性强的合成磷。2、胆固醇：脂质体基本是由磷脂、胆固醇构成的，胆固醇有一个外号流动性缓冲液，它可以调控膜的流动性根据结构。传递体又称为柔性纳米脂质体，10%~24%的磷脂胆碱和胆酸钠和5%左右的乙醇构成了变形能力优越的膜质。因为传递体膜质的高度变形性加上渗透压的驱动，使得传递体可以从小于自身十分之一的角质层微孔穿过。因其具有趋水性，它可以深入到皮肤的内里含水量最多的皮肤层，一半以上的药物可以被传递体传输透过皮肤表层。相比于传统脂质体，传递体可以同时传输药物穿过一个相对大面积的皮肤。它通过透皮进入血液循环的量和传统脂质体皮下注射进入血液循环的量几乎相似^[3]。醇脂体是一种乙醇含量很高的脂质体，它对包括亲水或亲脂的药物都有很好的封装能力^[4]。用相同的方法制造出的醇脂体和传统脂质体，传统脂质体粒径更大且包封率和流动率较差，醇脂体粒径更小并且有较高的包封率和流动率，而且醇浓度越高粒径越小。醇脂体也可以把药物传送到皮肤深层。醇脂体能渗透进不规则的脂质双分子层，它是一种柔软的载体其延展性很强，可以促进药物进入血液循环。微乳是由油相、乳化剂、助乳化剂和水相组成的分散体,其中的表面活性剂可以降低角质层的屏障作用^[5]。

1.1.2 脂质体的质量控制

药物的质量研究是药品研发过程中至关重要的一环，药品研发和评价必须遵循的基本守则是保证药品安全、有效、质量可控，在药品研发过程中对其采取质量控制是保证药品安全有效必不可少的方式和途径^[6]。药品的质量控制不仅事关医药行业的长期稳定发展，而且还与广大消费者的生命安全息息相关。所以，我们必须要慎重对待药品质量研究。

外观、粒径、zeta电位、包封率是评价脂质体质量的几个重要参数之一，并且，制剂通则的规定也是必须要符合的。

目前检测脂质体大小最常用的方法是电子显微镜法和激光散射法,如果需要观察脂质体粒径分布情况和外形可以使用透射电子显微镜^[7]，测定粒径及粒度分布可以使用激光粒度仪。表征胶体稳定性的一个重要指标是Zeta电位，Zeta电位可以用激光粒度仪来进行测定，脂质体粒度也可以用激光粒度仪来进行测定。

测定脂质体包封率的方法比较多，基本原理大多都是先把药物分离出来，再测定被包封的药物和没有被包封游离的药物，最后通过公式计算出包封率。但是也有一些只要通过荧光染料上色来间接显示包封率的特殊脂质体^[8]。使用分离游离药物的方法测定包封率适用于常见的大部分脂质体。超速离心法、葡聚糖凝胶法、透析法是多种游离药物分离的方法。渗透率和包封率测定方法相同，计算方法不同。

脂质体中的磷脂容易被氧化，所以需要对脂质体采取氧化程度检查，评价指标为过氧化值。

乙醇、氯仿等有机溶剂是制备脂质体的一些常用辅料，需要使用顶空-气相色谱法进行检测，因为这些都是有害有机溶剂。

1.1.3脂质体的特点及给药途径

1。靶向和淋巴靶向：被动靶向肝和脾网状内皮系统^[17]。2、缓慢释放：缓慢释放，延缓肾脏排泄和代谢，从而延长作用时间^[18]。3、降低药物毒性，不经过血液肾脏循环，局部用药，对全身副作用小^[19]。4、提高稳定性。5、可以持续控制给药的速度，在表皮用药，可以随时停药，方便患者使用。6、无创伤，不需在表皮开创口，使用方便，符合大众需求。吸附：脂质体的全身作用开始于吸附。融合：脂质体可以融合到细胞中，因为脂质体的膜材料与细胞膜的组成相似，然后通过溶酶体消化释放^[9]。2、脂质体由与细胞膜相同的磷脂组成,它可以应用于多种药物输送方式,如：静脉注射，肌肉注射和皮下注射等^[10]。

1.1.4脂质体在药学上的应用

脂质体在药学上的应用十分广泛，可以作为抗肿瘤靶向药的载体也可以作为抗生素药物的载体，或者可以作为一些激素类药物和免疫调节剂的载体，甚至可以作遗传基因的载体使用。脂质载体是目前使用较为广泛的载体之一。脂质载体是肿瘤载体应用一种第四阶段药物制剂。对肾的毒性明显小于顺铂。英国SKYYPHA制药公司利用阿糖胞苷脂质体技术平台（DePooFAM）制备阿糖胞苷脂质体注射液（DePOCyt），主要用于治疗淋巴性脑膜炎^[20]。目前，爱尔兰公司ELAN开发了柠檬酸阿霉素脂质体注射（MyoCET），主要用于乳腺癌的治疗^[21]。血浆蛋白的结合率高于注射，且多西他赛脂质体的IC50低于注射，且对肿瘤细胞的抑制作用强于注射^[11]。

1.1.5透皮给药

透皮给药系统(transdermal therapeutic system, TTS; transdermal drug delivery system, TDDS)，是一种通过在皮肤表面使用药物通过药物载体将药物传输进入血液循环的药物新型制剂。在皮肤表面给药，通过人体的毛孔呼吸，使得药物以一定的速度通过皮肤进入血液循环产生作用^[12]。透皮给药通过皮肤传递药物不用经过肝脏循环，对全身的副作用小，给药次数少，一次给药可以维持长时间给药状态，方便病人使用，患者使用时自身没有痛苦。随着透皮给药技术的发展，对药物载体的需求也越来越多，透皮效率是衡量载体透皮性能的重要指标。

1.2黑色素瘤概述

1.2.1黑色素瘤的定义

黑色素瘤是最恶性的皮肤肿瘤，容易发生转移。在亚洲人和有色人种中，最常见的发病部位是肢端肥大症，即指足、趾、末端、指甲的下部，其次是粘液黑色素瘤，以及WH的两种亚型。在欧洲和美国的人只占5%的黑色素瘤。

1.2.2黑色素瘤的病因

紫外线过度辐射造成美国和欧洲白血球的重要原因之一。紫外线辐射烧伤皮肤，使得DNA变异并引发黑色素瘤。光敏性皮肤、大量常见痣家族史是黑色素瘤产生的高危因素。肢端黑色素瘤在亚洲和非洲的病例很少，病因还未清楚。治疗不当可引起色素痣的恶性转化和快速生长，如刀、绳、盐、激光、冷冻等，内分泌、化学和物理因素对黑色素瘤的产生究竟是否有影响还尚不清楚^[12]。

1.2.3黑色素瘤的治疗方法

手术治疗：扩大切除术：早期扩大黑色素瘤在活检证实后，在病理报告中根据肿瘤浸润深度确定安全切除刃口^[13]。（1）如果病变位置的厚度小于1.0mm，那么安全切削刃为1cm；若果病变位置厚度为1.01～2mm时，那么安全切削刃为1～2cm。；（4）最新的循证医学证据支持厚度为4mm时的2C安全裕度。M（2）前哨淋巴结活检（SLNB）：1mm厚的患者可考虑SLNB。但根据以往大数据统计结果显示我国皮肤黑色素瘤的发病率高达60%，如果还伴有皮肤溃疡则预后很差，因此在活检技术或病理检查技术有限的情况下，推荐SLNB在溃疡患者中应用。找不到渗透深度。淋巴结清扫术中淋巴结清扫术是推荐的，区域淋巴结清扫应在前哨淋巴结阳性或经影像学和临床检查扩大切除的基础上进行，以确定局部淋巴结转移（但无远处转移）^[14]。（4）肢体转移：肢体转移主要表现为原发性肢体和局部淋巴结皮肤、皮下及软组织广泛转移^[22]。仅依靠行外科手术无法全部切除。主要使用单独的热灌注化疗（ILP）和单独的热灌注化疗（ILI）来治疗肢体转移。ILI是一种局部化疗，用于化疗药物的低流量和低流量输注。手术切除仅存在于第IV期患者独立转移。（2）皮肤黑色素瘤的辅助治疗：在肿瘤切除术后预后根据危险因素而不同。

1962年Monroe E. Wall和Mansukh C. Wani首次发现紫杉醇，随后被Taxus brevifolia从太平洋紫杉中离出来命名为“taxol”^[23]，是一种三环二萜化合物（结构如图所示）可治疗多种类型的癌症，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌 、宫颈癌、Kaposi肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤等，但是该药毒副作用强并且不溶于水，现阶段临床使用是将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油和乙醇1：1混合的溶液中，注射给药前进行稀释^[24]。紫杉醇是细胞骨架药物中的一种，作用于微管蛋白，用于治疗细胞纺锤体组装、染色体分离、以及分裂缺陷。不像其他微管蛋白药物如秋水仙素，抑制微管自组装，紫杉醇可固定微管的聚合，因此，细胞有丝分裂期无法形成纺锤体和纺锤丝，阻止细胞有丝分裂延长有丝分裂触发凋亡或者回归到细胞循环G期无细胞分裂。近期有研究表明低浓度紫杉醇能够在不影响细胞微管自组装的情况下抑制血管再生。紫杉醇是目前发现的最优秀的天然抗癌药物，但是低水溶性限制了其在临床上的应用。因此，需要研发紫杉醇药物传送系统，提高其溶解度、渗透性、稳定性及靶向性，减少药物的毒副作用提高治疗效果。至今，已经有一些成功的处方，如：Abraxane（白蛋白结合紫杉醇纳米粒），Lipusu（紫杉醇脂质体注射液），Genexol-PM（紫杉醇聚交酯-聚乙二醇胶束）[62]。黑色素瘤是紫杉醇治疗的癌症之一，因此目前已经有一些有关紫杉醇治疗黑色素瘤的报道。Shixian Lv [63]等利用3,3-二羟氧磷酸功能化的聚乙二醇-b-聚L-赖氨酸（mPEG-b-P(LL-DTPA）通过缩聚反应连接紫杉醇形成

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