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摘 要

糖基转移酶(Glycosyl Transferases)是能够催化糖基供体上的单糖基团转移到糖基受体同时形成糖苷键的一类酶。GTs具有很强的底物专一性，其中葡萄糖基转移酶是在反应中转移葡萄糖基的酶。

人参的主要有效成分是“人参皂苷”，它具有抗氧化，消炎，提高免疫力等功能。而含量更少的稀有人参皂苷则有更多的药理学活性。例如，稀有人参皂苷Rh2就有很好的抗肿瘤活性。生物合成人参皂苷步骤包括二十多步连续的酶促反应。糖基转移酶介导的糖基化是合成人参皂苷的最后一个步骤，主要过程是核苷二磷酸糖活性糖分子被GTs转移到人参皂苷苷元上，从而形成糖苷键。

之前用糖基转移酶生产人参皂苷大部分是用的生物酶法，目前固定化法已经成为了当前的热点。本研究使用具有自主知识产权的来源于Bacillus subtilis的糖基转移酶YjiC变体M315F为出发点，大孔树脂为承载体，研究了不同树脂和使用不同交联剂活化后获得的活性基团对此酶固定化效果的影响。并对修饰前后载体以及固定化条件进行了一系列的优化与表征。通过对LX1000HG进行双官能团修饰后获得的载体LX1000HG-glyoxyl-Ni² 对M315F的酶活回收率达65.1%。并对乙醛基固定化效果进行评价发现经LX1000HG-glyoxyl-Ni² 固定化后的酶在连续使用七次后并无明显活力损失。对固定化过程进行优化，确定最优吸附时间为 6 h，最优温度为 25 ℃，最优pH 8.0，最佳总加酶量 800 mU ，在此条件下进行固定化，得到了酶活力734.2 mU/g的糖基转移酶M315F。

关键词：糖基转移酶、固定化、大孔树脂

The immobilization of sugar transferase Bs-GT with macroporous resin was studied

Abstract

Glycosyl Transferases are a class of enzymes that catalyze the transfer of monosaccharide groups from sugar donors to recipient substrates and form glycoside bonds. GTs has a high level of substrate specificity, among which glucosyltransferases are the enzymes that transfer glucosylates in the reaction.

Ginsenoside is the main active ingredient of ginseng, which has the functions of anti-inflammatory, anti-oxidation and improving immunity. However, rare ginsenosides have more pharmacological activities, such as Rh2, which has a good anti-tumor activity. The biosynthesis pathway of ginsenosides includes more than 20 continuous enzymatic reactions. Glycosylation mediated by glycosyltransferase is the last step in the synthesis of ginsenoside. The main process is to transfer the active sugar molecules of nucleoside diphosphate to the ginsenoside substrate, thus forming glycoside bonds.

The biosynthesis of ginsenosides by glycosyltransferase has been a hot topic in recent years. In this study, the YjiC variant M315F from Bacillus subtilis with independent intellectual property rights was used as the starting point and the macroporous resin as the carrier. The effects of different resins and active groups obtained after activation with different crosslinking agents on the immobilization of the enzyme were studied. A series of optimization and characterization of the carrier and immobilization conditions before and after the modification were carried out. The enzyme activity recovery of M315F by LX1000HG hg-glyoxyl-ni2 was 65.1%. The results showed that the enzyme immobilized by lx1000hg-glyoxyl-ni2 showed no significant loss of vitality after seven consecutive use. The immobilization process was optimized to determine the optimal adsorption time of 6 h, the optimal temperature of 25 ℃, the optimal pH of 8.0, and the optimal total enzyme dosage of 800 mU. Under these conditions, immobilization was carried out, and the enzyme activity of 734.2mU/g of glucosyltransferase M315F was obtained.

Key Words: Micro-nano structure; solar cell; light trapping structure; size parameter; absorption rate

目录

摘要…………………………………………………………………………………I

ABSTRACT……………………………………………………….……….……..III

第一章 绪论 1

1.1 人参皂苷 1

1.2 糖基转移酶 1

1.2.1 糖基转移酶 1

1.2.2 糖基转移酶的分类及反应机制 2

1.2.3 糖基转移酶合成人参皂苷Rh2 2

1.3 固定化酶 3

1.3.1 固定化酶的载体材料 3

1.3.2 固定化酶的制备方法 4

1.3.3 固定化糖基转移酶 5

1.3.4 固定化酶法生成人参皂苷 5

1.4 本研究的立题意义和研究内容 6

1.4.1 立题意义 6

1.4.2 研究内容 6

第二章 实验材料和方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与培养基 7

2.1.2 实验试剂 7

2.1.3 实验仪器设备 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 大孔树脂载体表面修饰 8

2.2.2 糖基转移酶的固定化 12

2.2.3 多官能团固定化效果验证 13

2.2.4 糖基转移酶酶活检测方法 13

2.2.5 人参皂苷Rh2含量的液相色谱分析 14

2.2.6 蛋白质含量检测方法 14

2.2.7 固定化参数计算方法 15

第三章 结果与讨论 16

3.1 不同载体对固定化酶的影响 16

3.2 多官能团多固定化效率的影响 17

3.3 多官能团固定化效果验证 17

3.4 固定化过程优化 18

3.4.1 吸附时间对固定化酶的影响 18

3.4.2 温度对固定化酶的影响 19

3.4.3 pH对固定化酶的影响 20

3.4.4 加酶量对固定化酶的影响 21

3.4.5 结论 22

第四章 展望 23

参考文献 24

致谢 27

绪论

人参皂苷

人参是百补之王，而其中的主要药效成分便是人参皂苷中含量较低的稀有人参皂苷。而人参种植生长的周期很长，大部分还有农药残留、土壤重金属污染等问题^[1-2]。

人参皂苷实质上是一种糖苷类化合物，其由糖和苷元连接而成，按照苷元的种类不同，将人参皂苷分为：齐墩果烷型皂苷、人参二醇型皂苷还有人参三醇型皂苷。Rh2是人参二醇型皂苷，能很优秀地抗击癌细胞的活性。经过许多研究证明，Rh2可使癌细胞分裂生长减缓，抑制肿瘤增殖，甚至引起癌细胞自然凋亡 ^[3-4]。

糖基转移酶

糖基转移酶

糖基转移酶(Glycosyl Transferases)是能够催化糖基供体上的单糖基团转移到糖基受体同时形成糖苷键的一类酶，作用是催化特定的糖和受体之间糖苷键的形成，它的催化底物是生物分子，例如糖、蛋白质、脂质等其他小分子^[5]，并完成后者糖基化加工来实现其生物学功能^[6]。糖基转移酶有非常高的底物特异性，就是对糖基的供体和接受体的特异性。大部分的糖基转移酶把不同类型的核苷二磷酸活化的单糖当作糖基供体，不同的单糖用各自对应的的核苷二磷酸活化。但也有例外，比如同样是葡萄糖基转移酶，由于需要合成的产物结构不同，或者合成的部位不同，所使用的糖基供体上的核苷二磷酸也将不同^[7]。由糖基转移酶合成的一些糖苷化合物如图1-1。

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