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摘 要

糖基是许多糖苷类化合物中是中药的活性基团，在识别靶点，提高药物生物利用度，降低毒副作用等方面有重要的作用。糖基转移酶催化合成糖苷类化合物是人工合成糖苷类药物的常用方法之一，相比于化学合成方法，酶催化反应具有催化效率高，底物特异性以及绿色环保的优点。

白藜芦醇是一种二苯乙烯类化合物，具有共轭结构，苯环上有多个羟基取代。在桑葚、虎杖以及红酒中广泛存在。具有预防动脉粥样硬化，抗高血脂，抗肿瘤的活性。虎杖苷是白藜芦醇的3-β-O-葡萄糖基化产物。要利用生物方法实现人工合成虎杖苷，还需要提高糖基转移酶的区域选择性，使其能够更加倾向于催化白藜芦醇的3位羟基与糖基结合，而减少糖基与其他位点的羟基发生作用。

目前对于改造糖基转移酶区域选择性的方法报道不多，高通量筛选方法也有待进一步研究，未能起到有效地作用。我们采用半理性改造糖基转移酶，采用定点选择对糖基转移酶进行改造，用丙氨酸扫描的方法寻找合适的突变位点，最终决定对活性口袋附近的62位氨基酸进行突变，从而提高其对白藜芦醇底物特定位点的选择性，减少其他副产物的生成，提高合成效率。同时在该酶62G突变体的基础上进行81位脯氨酸的进一步突变，验证同时突变81位脯氨酸能否进一步提高糖基转移酶催化糖基化反应的区域选择性。

关键词：糖基转移酶 白藜芦醇 区域选择性 半理性改造 丙氨酸扫描

Site-directed mutagenesis modified UGTBL1 regioselectivity of glycosyltransferase

Abstract

Glycosyl is the active group of many glycosides in traditional Chinese medicine, which plays an important role in identifying targets, improving drug bioavailability, reducing side effects and so on. The synthesis of glycosides catalyzed by glycosyltransferase is one of the common methods for the synthesis of glycosides. Compared with chemical synthesis, enzyme-catalyzed reaction has the advantages of high catalytic efficiency, substrate specificity and green environmental protection. Resveratrol is a stilbene compound with conjugated structure and several hydroxyl groups on the benzene ring. It is widely found in mulberry, Polygonum cuspidatum and red wine. It has the activity of preventing atherosclerosis, anti-hyperlipidemia and anti-tumor. Polydatin is the product of 3-β-O-glucylation of resveratrol. In order to realize the artificial synthesis of polydatin by biological methods, it is also necessary to improve the regioselectivity of glycosyltransferase so that it can be more inclined to catalyze the binding of 3 hydroxyl groups of resveratrol to sugar groups and reduce the interaction between sugar groups and hydroxyl groups at other sites. At present, there are few reports on the methods of modifying the regioselectivity of glycosyltransferase, and the high-throughput screening methods need to be further studied, which can not play an effective role. We adopted semirational modification of glycosyltransferase, modified glycosyltransferase by site selection, found a suitable mutation site by alanine scanning, and finally decided to mutate the 62 amino acid near the active pocket. so as to improve its selectivity to the specific sites of resveratrol substrate, reduce the formation of other by-products, and improve the efficiency of synthesis. At the same time, the 81-position proline was further mutated on the basis of the 62G mutant of the enzyme to verify whether the simultaneous mutation of 81-position proline could further improve the regioselectivity of glycosylation catalyzed by glycosyltransferase.

Key Words: Glycosyltransferase；resveratrol；regioselectivity；alanine scan

目录

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摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 糖苷类化合物概述 1

1.1.1 常见糖苷类化合物 1

1.1.2 对白藜芦醇的糖基化改造 1

1.2 糖苷类产物合成方法 2

1.2.1 化学合成法 2

1.2.2 酶催化合成法 2

1.2.3 糖基转移酶的区域选择性 3

1.2.4 分子动力学模拟及分子对接技术 4

1.2.5 丙氨酸扫描技术 4

1.2.6 酶催化合成糖苷的优化方法 5

1.3 本课题的研究意义及主要研究内容 5

1.3.1 研究内容 5

1.3.2 研究意义 5

第二章 实验方法 6

2.1 材料与仪器 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 计算机辅助蛋白同源建模及突变位点选择 6

2.2.2 同源建模 6

2.2.3 丙氨酸扫描确定突变位点 7

2.2.4 全质粒PCR和突变 7

2.2.5 糖基转移酶及突变体的诱导表达 7

2.2.6 催化产物分析 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 同源建模结果 9

3.2 关键催化氨基酸残基突变验证 9

3.3 丙氨酸扫描筛选突变体 9

3.4 突变体I62G联合81位突变改造 10

3.5 HPLC以及动力学参数 11

第四章 结论与展望 13

4.1 结论 13

4.2 展望 13

参考文献 14

致谢 16

文献综述

1.1 糖苷类化合物概述

1.1.1 常见糖苷类化合物

苷即是糖与非糖组成的化合物。自然界存在许多天然的糖苷类化合物，如甜菊苷，熊果苷，洋地黄苷，水杨苷等，许多糖苷类化合物因其独有的甜味被作为食品添加剂广泛应用于食品领域^[1]。

许多糖苷化合物具有一定的生物活性，能够作为药物的先导化合物^[2]。水杨苷有镇痛活性，随后经过一系列的修饰合成了乙酰水杨酸，是常用的解热镇痛抗炎药^[3]，洋地黄苷则是典型的强心药物，常用药物地高辛结构中也含有糖结构。研究发现这些糖苷类化合物的糖结构对于它们的理化性质，药理活性有很大的影响，糖分子通常是小分子，极性大，水溶性好，糖基数量越多往往化合物的极性也越大。糖基结构对于糖苷化合物的生物活性也是必不可少的。中国著名的中药人参的主要活性成分就是其中的人参皂苷^[4]。而中药多含有大量的糖苷化合物，想要从中提取纯度较大的单一产物比较困难，因此研究人员开始探索糖苷化合物的人工合成。

1.1.2 对白藜芦醇的糖基化改造

白藜芦醇属于多酚类化合物，多来源于买麻滕科植物中，最先在葡萄中发现。在传统工艺酿造的葡萄酒中也发现了白藜芦醇的存在，法国人喜欢饮用红酒，而调查表明法国人冠心病的发病率低于其他国家，继而有研究人员推测白藜芦醇对心血管有保护作用。 随后对白藜芦醇的研究发现它具有抗氧化，抗骨质疏松，抗高血压，抗癌^[5]，治疗带状疱疹，治疗支气管^[6]等多种药理作用。白藜芦醇难溶于水，这给它的应用带来了极大的难度。而对白藜芦醇进行糖基化修饰后得到的白藜芦醇苷则可增大化合物的极性，较易溶于水^[7]。并且白藜芦醇苷可有效降低餐后血糖，有望成为治疗糖尿病的新药^[8]。

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