1.研究背景介绍

肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的重要生理功能。由于肝脏体积大，质地脆，一旦遭受暴力容易损伤，发生腹腔内出血或胆汁泄漏，引起出血性休克或胆汁性腹膜炎，后果严重，必须及时诊断和正确处理。肝细胞损伤会使肝细胞失活，失去生理功能，肝损伤如果长期放任不管，最终的结果会恶化，甚至诱发癌变。肝癌是临床最常见恶性肿瘤之一，全世界每年约 100 万人死于肝癌 ^[1]，也是继肺癌之后的癌症死亡的第二大原因，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别位居第 5 位和第 2 位 ^[2]。虽然手术切除和其他先进的治疗技术已经提高了肝细胞癌患者的生存率，但他们的预后仍然很差^[3]。由此可见，探索肝损伤防治的新靶点，开辟一条安全有效的治疗途径，是目前亟待解决的难题。WBP2是增强YAP / TEAD介导的基因转录的YAP的重要辅因子，它与TAZ（YAP/TAZ）的相互作用依赖于TAZ的WW结构域和Wbp2的含PPXY的C末端区域，并促进了癌基因TAZ的转化能力。基于研究结果及本课题组积累资料，本研究旨在以斑马鱼为模型探索WBP2在肝脏病变中的作用及其作用机制，为肝损伤防治探索新途径。

2.Hippo 信号通路与肝癌的发生及进程

目前肝癌的发病机制尚不十分清楚，近年细胞信号通路对其形成、发展的调节作用备受关注。Hippo 信号通路在 20 世纪 90 年代由国外学者提出，首先在果蝇体内发现，其组成、生物学功能以及分子作用机制在进化过程中高度保守 ^[4] 。Hippo 信号通路的主要功能是限制细胞的生长增殖及诱导细胞凋亡，维护并调控机体的内环境稳定和组织器官大小 ^[5] 。当前认为 Hippo 信号通路由 3 大类分子结合而成，且这些分子具有类似功能：核心分子如 Mstl/2、Savl、Mobl、 Latsl/2，上游调节分子包括 Kibra、Mer、Ex 等，主要效应分子有 Yki/Yap ；其中核心分子以及上游调节分子为抑癌基因，主要效应分子属于癌基因 ^[6]。Hippo 信号通路与其他信号通路存在不同程度的交联作用，具有复杂多变等特点，因此通过对其他信号通络的参与调节可能在癌细胞的形成中发挥了作用 ^[7]。目前 Hippo 信号通路已被证实参与包括肝脏在内的多个器官肿瘤的发生。Grijalva 等 ^[8] 检测在已切除 70％肝脏动物模型发现，细胞核内 YAP 靶基 因的表达和活化水平在肝脏切除 24 h 内明显升高，且在肝细胞再生启动之前会持续升高 72 h，而 Hippo 信号通路中的核心组件 Mstl/2、LatSl/2 及 Mobl 活化水平显著降低，余下 30％肝脏大概在 7 d 内恢复时细胞核内 YAP 及其靶基因水平又恢复至生理水平。文献报道 Hippo 信号通路将上游的转录信号通过级联反应并使下游靶点或分子发生磷酸化，使细胞核剔除掉失去活性的 YAP 因子，转变信息为抑制生长发育的信号，以对细胞数量和器官大小达到有效控制 ^[9]。

3.Hippo 信号通路中YAP因子对肝癌发生的作用

YAP是 Hippo 信号通路中关键的致癌调节因子，研究表明，多种肿瘤细胞中的 YAP 表达明显增加，下调 YAP mRNA 高表达对抑制癌细胞生长起到关键作用 ^[10]。活化 YAP 因子能够上调 H19、Ki267、2myc、AFP、SOX4 等细胞增生基因以及 Survivin、cIAP-1 等凋亡抑制基因，进而打破机体内的细胞动态平衡，为肿瘤的发生、发展提供内环境 ^[11]。Liu 等 ^[12] 报道了 YAP 基因是一种肝癌预后的独立危险因子，MicroRNA-375 可通过抑制 Hippo 信号通路中的 YAP，防止控性 YAP 蛋白增多，最终对肝癌细胞的增殖、侵袭起到抑制效果。Xu 等 ^[13] 采取免疫组织化学、定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹等方法测定 177 例癌组织及癌旁正常组织 YAP 的表达，发现 62％肝癌病例中 YAP 都明显升高，且 YAP主要表达于肿瘤的核心位置，同时肝癌组织中 YAP 高表达与肿瘤的低分化程度和体内高甲胎蛋白水平存在明显相关。Li等 ^[14]对105 例行肝脏移植术的原发性肝癌患者分析证实，YAP表达阴性的肝癌患者肝移植术后的无病生存率显著高于 YAP 表达阳性的肝癌患者，采取多因素 COX 回归分析发现肝癌组织中 YAP 表达是肝癌患者肝移植术后无瘤生存率的独立预测因子之一。 Xu 等 ^[15] 通过体外细胞培养移植实验证实，提取鼠胚胎的肝癌干细胞，将其接种于实验鼠，能够诱发肝癌的发生， 测定肿瘤细胞中 YAP 基因发现实验鼠体内表达明显升高。 这些研究均表明 Hippo 信号通路的 YAP 基因表达水平与肝癌形成有着密切联系。

4.WBP2与Yap在肿瘤中的相互作用

WW结构域结合蛋白2（WBP2），一种结合Hippo途径转录因子YAP / TAZ的转录共激活因子。WW结构域由38至40个与结构，调节和信号蛋白共有的半保守氨基酸组成^[16]。 WBP2，作为WW结构域蛋白的结合配偶体，与几种含WW结构域的蛋白质相互作用，例如Yes激酶相关蛋白（Yap）。Walko^[17]等人进行了全基因组合并的RNA干扰筛选，并鉴定了在正常和肿瘤（皮肤鳞状细胞癌，cSCC）人表皮细胞上赋予克隆生长优势的基因。Hippo效应器YAP是两种筛选中的顶级正增长调节剂。通过将Hippo网络相互作用组与他们的数据集相结合，他们将WW结合蛋白2（WBP2）鉴定为YAP的重要辅因子，其增强YAP / TEAD介导的基因转录。YAP和WPB2在小鼠和人表皮和cSCC的活跃增殖细胞中上调，并在终末分化期间下调。WBP2的过表达和酪氨酸磷酸化的激活上调乳腺癌中Wnt和ER信号传导途径的交叉调节中的信号级联^[18]。在WBP2与TAZ的WW结构域结合后，其可以加速迁移，侵袭并且是乳腺癌细胞的转化表型所需的，MCF10A的上皮细胞向间充质细胞的转化被激活，表明WBP2是调节的关键参与者。当YAP和WBP2在体外共表达时，PR介导的转录活性显着增加，表明YAP主要通过WBP2蛋白的存在调节PR转录活性^[19]。Dhananjayan等人^[20]证明WBP-2结合蛋白，Yes激酶相关蛋白（Yap）增强PR反式激活，但YAP的共激活功能完全依赖于WBP-2。总之，他们的数据确定了WBP-2和YAP作为ER和PR反式激活途径的共激活因子的作用。

现已有研究^[21-22]表明Hippo信号通路的动态调节在肝脏的分化和功能成熟中起重要作用，Yap和Taz是Hippo途径在肝脏器官大小调节中的关键组成部分,是适当肝脏再生所必需的。且根据我们所查阅到的文献WBP2蛋白与YAP共同在乳腺癌中有显著作用，本研究旨在以斑马鱼为模型探索WBP2及YAP在肝脏病变中的作用及其作用机制。首先我们会进行WBP2基因表达序列在不同物种的同源相似性比较，再用PCR及western blot检测成鱼不同器官WBP2的表达情况，最后构建肝损伤模型，鉴定WBP2及其相关联Yap的表达变化，探索它们在肝损伤中的相互作用关系及作用机制，为肝损伤防治探索新途径。