论文总字数：19715字

摘 要

本文考察了姬松茸凝集素分离纯化时的最佳工艺条件，从提取缓冲液，料液比，温度，pH，时间等方面进行了研究，以2%兔血的凝集效价为评价指标，建立了姬松茸凝集素粗提取的工艺优化方案。研究表明，选用Tris-HCl为提取缓冲液，料液比1：20，提取温度4℃，pH 7.4，提取时间为18 h提取得到的姬松茸凝集素的凝集活性最高。此结论的得出为进一步开展凝集素的研究工作奠定了基础。

选用DEAE-Sepharose离子交换法对凝集素粗提物进行进一步的分离纯化，使用的洗脱方式是分部洗脱，对不同离子浓度洗脱下来的样品进行凝集活性检测，发现0.2 mol/L和0.3 mol/L NaCl洗脱下来的样品凝集活性最高，最后使用SDS-PAGE电泳检测纯化后样品的蛋白纯度。

关键词：凝集素 分离纯化 凝血实验 离子交换法

Separation and purification of Agaricus blazei lectin

Abstract

This paper examines the optimal experimental environment during the separation of purified Agaricus blazei lectin,The extraction buffer, solid-liquid ratio, temperature, pH, time and so on were studied.In 2% rabbit blood agglutination as the evaluation index, established the crude extraction technology of Agaricus blazei lectin.Research shows that, the selection of Tris-HCl as extraction buffer, solid to liquid ratio 1:20, extraction temperature 4, pH, extraction time for 18 h the plan extraction of Agaricus blazei Murill lectin agglutination activity was the highest.This conclusion is proved to be effective in the later stage of the experiment of coagulation and inhibition of bacteria.

DEAE-Sepharose ion exchange method was used for further separation and purification of lectin crude extract in Partial elution. The samples with different ion concentrations were detected, and the highest aggregation activity was found to 0.2 mol/L and 0.3 NaCl mol/L. Finally, the protein purity of purified samples was detected by SDS-PAGE electrophoresis.

key words : lectin; Separation and purification; Agglutination test; Ion exchange method

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 课题研究背景 1

1.2姬松茸背景分析 1

1.3 凝集素概述 1

1.3.1 凝集素命名 1

1.3.2 结构与功能 2

1.3.3凝集素的分布 4

1.4凝集素的功能 5

1.4.1细胞凝集 5

1.4.2 抗动物病毒 5

1.4.3 防御功能 5

1.5 凝集素的分离和纯化 6

1.6 课题研究的目的与意义 7

1.6.1 研究目的 7

1.6.2 研究意义 7

第二章 材料与方法 8

2.1仪器与材料 8

2.1.1仪器和设备 8

2.1.2药材与试剂 8

2.2实验方法 9

2.2.2 凝集素的粗提取 10

2.2.3超滤除盐方法 10

2.2.4 2%的兔血细胞悬液的制作 11

2.2.5 凝集效价检测 11

2.3 姬松茸凝集素提取工艺优化 11

2.3.1 硫酸铵饱和度的优化 11

2.3.2 提取缓冲液的选择 12

2.3.3料液比的选择 12

2.3.4 提取温度的选择 12

2.3.5 提取pH的选择 12

2.3.6提取时间的选择 13

2.4 DEAE-离子交换层析 13

2.5 SDS-PAGE电泳 13

2.5.1 原理 13

2.5.2 操作流程 14

第三章 实验结果与讨论 15

3.1 姬松茸凝集素提取工艺优化 15

3.1.2 提取缓冲液的选择 15

3.1.3 料液比的选择 16

3.1.4 提取温度的选择 17

3.1.5 提取pH的选择 17

3.1.6 提取时间的选择 18

3.2 DEAE离子交换层析 18

3.3 SDS-PAGE电泳分析 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 课题研究背景

第一个细胞凝集素是由StillMark于1888年发现的，距今已有100多年的历史，首个细胞凝集素的发现促使人们开始对其进行大量的研究。1966年，又一种新的凝集素—海藻凝集素，被人类发现。直到1970年以后，关于海藻凝集素的提取，纯化及理化性质的分析等方面的研究才开始大量进行。尤其是最近的40年，凝集素已成为生物及医学领域中的一个研究热点，所以，有关于凝集素的研究理所应当的成了最活跃的领域之一。

1.2姬松茸背景分析

姬松茸是一种腐生菌，生长在夏秋季节，喜好高温、多湿、通风的环境，具有杏仁香味，口感脆嫩，味纯5-7 g。18种氨基酸共同组成了姬松茸凝集素，其中有8种是人体必需氨基酸。

姬松茸具有药作用价值:姬松茸能强效抗病毒，它能阻止病毒和有害物体进入人体脆弱的组织，它能提高人体免疫性。姬松茸在提高人体免疫力、抑制肿瘤细胞等方面扮演着重要的角色。一些临床试验也证明：从姬松茸中提取出来的有效成分对提高人体免疫力的作用强于其它药用抗癌真菌。

姬松茸含有多种生理活性物质，如糖蛋白，核酸，多糖，甾醇类物质，脂质等，正是因为含有这些物质，姬松茸才具有免疫调节，抗肿瘤等药用功效。

1.3 凝集素概述

1.3.1 凝集素命名

在凝集素被认识之后的很长一段时间里，人们对凝集素本质的了解几乎是空白的^[1]，但对凝集素的凝集活性和血型鉴定的关系表现出了极大的兴趣，这种状态维持了很长的一段时间。1960年，Nowell发现，在细胞凝集素的作用下，植物可以进行有丝分裂活动^[2]，1963年，Aub发现凝集素对恶性细胞能选择性的进行凝集。其靶细胞表面受体糖基的存在是凝集素具有以上两种作用的主要原因，该受体糖基能够识别专一性糖，然后与该专一性糖结合或者使其沉淀，而且我们可以发现凝集素的本质是不具有免疫原性的，不具酶活性的蛋白质或糖蛋白^[3]。随着对凝集素的结构与功能的进一步研究，这个在很长一段时间里被普遍接受的定义也逐渐被人们修改。以前的研究认为：至少有不低于2个的糖结合位点在凝集素上，而且不论凝集素本身是不是有糖的存在，它的作用机制都是先和糖基（位于靶细胞表面的糖复合物上）结合再发挥其作用。现代研究得到的结论与先前的研究结果不同，很多凝集素不仅可以和糖特异性结合，这种凝集素-糖的结合位点可以单价的，两价的甚至多价的。凝集素不但可以和糖结合还可以和蛋白质结合，通过分析凝集素可结合的这两种物质，我们可以得出结论：凝集素是一种非免疫来源的糖结合蛋白或糖蛋白，并且其具有一定的凝集作用。

1.3.2 结构与功能

研究表明，凝集素这一生物大分子种类繁多而且无处不在，有千余种植物凝集素具有凝血活性，其中已有百余种被纯化并完全表征出来了，但只有十几种被测序，至于空间构型被揭示出来的更是少之又少^[4]，所以对于凝集素结构的研究仍需要科研工作者们付出更多的心血。一些凝集素因其来源的差异所以表现出结构上的差异，但一些同源凝集素所具有的共同特征可以作为一种依据用于凝集素的分类。

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