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摘 要

泛素样蛋白NEDD8在类泛素化蛋白中，是相对重要的一个，它和底物蛋白的联结进程叫做neddylation。Neddylation负责原癌基因蛋白翻译后折叠，调节与细胞的增殖、凋亡以及细胞周期相关蛋白的活性。研究显示，抑制 neddylation过程中的限速酶NEDD8 激活酶（NEDD8 activating enzyme，NAE）活性，可降低 neddylation活性，抑制cullin-containing RING-finger E3s（CRLs）介导的底物蛋白泛素化，下调底物蛋白的降解，以至于使得相关的蛋白在肿瘤细胞内积蓄，从而使肿瘤细胞的增殖被抑制，并且使肿瘤细胞的凋亡被诱导。因此，NAE在抗肿瘤药物中，已经成为了相当重要的靶点了。以NAE为靶点，将先导化合物M22与4，7-二取代香豆素拼合，设计合成一大类NAE抑制剂。一个新型的NEDD8激活酶抑制剂——1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶，简称M22。根据得到的药理结果，该化合物具有良好的NEDD8抑制活性、肿瘤细胞增殖的抵抗作用、肿瘤细胞凋亡的促进作用及体内的抗肿瘤活性，根据以上特性可知该化合物在临床上是可以用于制备治疗肿瘤的药物的。

关键词：NEDD8 NAE抑制剂 M22 肿瘤

Study on the anti-tumor drug in vivo activity of targeted ubiquitin pathwa

Abstract

Neural precursor cell-expressed development downregulated protein 8，is one of the most important class of ubiquitin protein, and its binding with the substrate protein is called neddylation.The NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8) conjugation pathway regulates the post-translational modification of oncogenic proteins. Several proteins vital in cancer biology such as cancer cell proliferation, cell cycle and cell apoptosis are regulated by protein neddylation. Inhibition of NEDD8 activating enzyme which is the rate limiting enzyme in neddylation will suppress the ubiquitination mediated by CRLs, and decrease degradations of related proteins, resulting in cancer cell proliferation inhibition and cell apoptosis. NAE has recently emerged as a new target for the treatment of cancer. So with NAE as a target, M22 will lead compounds and 4,7-substituted coumarin split, designed and synthesized a large class of inhibitors of NAE.NEDD8 a new activation inhibitor ——1-benzyl-4- (2,4-dichloro-phenylethylamine yl) piperidine (referred to as M22). Pharmacological results show that the compounds have good NEDD8 inhibitory activity, anti-tumor cell proliferation and promote apoptosis of tumor cells and in vivo anti-tumor activity is clinically useful for preparing pharmaceutical treatment of tumors.

Key Words: NEDD8; NAE inhibitors; M22; Tumor

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 实验背景 1

1.1研究背景 1

1.2泛素-蛋白酶体通路 1

1.3 NEDD8通路 3

1.4 NAE 抑制剂 MLN4924 的结构及作用原理 4

第二章 细胞增殖抑制实验 8

2.1实验材料 8

2.1.1细胞株 8

2.1.2主要试剂 8

2.1.3耗材 8

2.1.4 仪器 9

2.2.实验步骤 9

2.2.1细胞传代培养 9

2.2.2实验分组 10

2.2.3 M22与硼替佐米联合用药效果 10

2.3.实验结果 11

第三章 细胞凋亡测试 13

3.1.实验材料 13

3.1.1细胞系 13

3.1.2化合物 13

3.1.3主要试剂 13

3.1.4主要仪器 13

3.2.实验方法 14

3.2.1主要试剂的配置 14

3.2.2Hoechst/PI染色荧光显微镜检测细胞凋亡 14

3.2.3 Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞仪检测细胞凋亡 14

3.3.实验结果 15

第四章 体内抗肿瘤实验 17

4.1实验材料 17

4.1.1细胞系 17

4.1.2化合物 17

4.1.3主要试剂 17

4.1.4主要仪器 17

4.1.5实验动物 17

4.2实验方法 18

4.2.1主要试剂配置 18

4.2.2实验步骤 18

4.3实验结果 18

第五章 结论与展望‍ 20

5.1结论 20

5.2展望 21

参考文献 22

致 谢 26

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