论文总字数：19133字

摘 要

紫丁香苷别名刺五加苷B，是一种无色结晶， 研究发现紫丁香苷具有较好的抑制P-gp，协同阿霉素增效的作用，且本身化合物水溶性较大，不会与CYP3A4出现竞争性抑制。本实验主要是想通过紫丁香苷协同阿霉素来诱导乳腺癌MCF-7/ADR凋亡的活性研究，再而利用紫丁香苷调控hPXR核转录抑制P-gp基因( MDR1)和蛋白表达的分子机制。本实验具体通过MTT实验、流式细胞术研究紫丁香苷协同阿霉素诱导MCF-7/ADR凋亡的情况，然后通过Western blot，罗丹明123外排实验，QPCR，激光共聚焦技术研究紫丁香苷对P-gp的影响，再而通过免疫荧光判断目标蛋白有无表达。实验结果表明紫丁香苷协同阿霉素后对P-gp的抑制作用大大加强，从而表明紫丁香苷协同阿霉素后大大抑制了乳腺癌MCF-7/ADR细胞膜上P-gp的过表达。

关键词： 刺五加苷B P-糖蛋白 多药耐药性 阿霉素

Effect of Acanthopanax B on reversal of adriamycin resistance in breast cancer MCF-7 cells by inhibiting P-glycoprotein

Abstract

Lutein glycosides alias AcanthopanaxB Glycoside B,Is a colorless crystal, the study found that syringin has a good inhibition of P-gp, synergistic effect of doxorubicin synergies, and its own compound water-soluble, will not Competitive suppression with CYP3A4. In this study, we wanted to study the activity of MCF-7 / ADR apoptosis induced by violet syringin in combination with doxorubicin, and then control the expression of P-gp gene (MDR1) and protein Molecular mechanism. In this study, MTT assay and flow cytometry were used to study the apoptosis of MCF-7 / ADR induced by pilocylicin in combination with doxorubicin. The expression of MCF-7 / ADR was studied by Western blot, rhodamine 123 efflux test, QPCR, laser confocal technique The effect of syringin on P-gp, and then by immunofluorescence to determine whether the target protein expression. The results showed that the inhibitory effect of podsin on P-gp was enhanced, and the expression of P-gp in breast cancer MCF-7 / ADR cell membrane was greatly inhibited by adriamycin.

Key Words: Acanthopanax B;P-glycoprotein;MDR;Adriamycin

目录

起迄日期： 2017/3—2017/6 I

摘 要 I

Effect of Acanthopanax B on reversal of adriamycin resistance in breast cancer MCF-7 cells by inhibiting P-glycoprotein II

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2刺五加苷B（紫丁香苷）药理作用的研究 1

1.2.1对免疫功能的调节作用 1

1.2.2抗肿瘤作用 1

1.2.3对心脑血管系统的影响 2

1.2.4抗菌、抗病毒作用 2

1.2.5 P-糖蛋白的抑制作用 2

1.3 P-糖蛋白 3

1.3.1 P-糖蛋白的作用机制 3

1.3.2 P-糖蛋白表达下的乳腺癌细胞MCF-7-ADR及MDR 4

1.3.3 P-糖蛋白与细胞凋亡 5

1.4 阿霉素耐药逆转的研究 5

1.5 多药耐药性 5

1.5.1肿瘤MDR产生的机制 6

1.5.2肿瘤MDR的主要逆转策略 6

第二章 刺五加苷B通过抑制P-糖蛋白逆转乳腺癌MCF-7细胞阿霉素耐药性的研究方法 8

2.1实验试剂 8

2.2细胞培养 9

2.3细胞活性检测 9

2.4 AnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）染色 10

2.5 蛋白质印记（Western blot） 10

2.5.1 蛋白质样品制备 11

2.5.2 蛋白质定量 11

2.5.3 SDS-PAGE 电泳 12

2.5.4转膜 12

2.5.5免疫杂交反应 13

2.5.6化学发光（ECL） 13

2.5.7凝胶图象分析 13

2.6免疫荧光实验 13

第三章 结果与讨论 15

3.1细胞活性检测 15

3.2 AnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）染色 15

3.3 Western blot 16

3.4 免疫荧光 16

第四章 结果与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致谢与结语 23

第一章 文献综述

1.1前言

紫丁香苷的别名即是刺五加苷B；(2R,3S,4S,5R,6S)-2-羟甲基-6-[4-[(E)-3-羟基丙-1-烯基]-2,6-二甲氧基苯氧基]氧杂环己烷-3,4,5-三醇 。刺五加苷B通过抑制p-gp糖蛋白逆转乳腺癌MCF-7细胞阿霉素耐药性。此次研究的癌症是在导管的上皮产生的不良肿瘤，是目前较常遇到的肿瘤之一，同时也为女性易得的不良肿瘤。P-糖蛋白占最多内在和获得性的癌症多药耐药性。 已经证明天然存在的化合物Honokiol通过包括抑制血管发生和诱导凋亡的机制来抗癌。 在这里，我们发现，紫丁香苷在乳腺癌MCF-7细胞中有效抑制了P-糖蛋白的表达。 P-糖蛋白的下调伴随着细胞内药物积累的部分恢复和对阿霉素的敏感性

1.2刺五加苷B（紫丁香苷）药理作用的研究

1.2.1对免疫功能的调节作用

免疫功能在内部如何作用在郑日男^[1]一组的钻研下，发现：紫丁香苷遭到破坏的胃部粘膜比对照组轻。紫丁香苷对器官的缺血伤害经常运用多种皂苷、维生素的几类以及胡萝卜素来抵制自由基,提高了重要系数的活跃力同时抑制降低阻碍系数含量,通过抑制脂肪物质的过度氧化起到了防护作用;利用阻碍白细胞生长,抑制生成氧自由基,对缺血胃粘膜伤害做到保护作用;利用抑制破坏条件防卫胃粘膜;提高杀菌细胞活性,诱导干扰素和白细胞介素-2以增强机体的免疫。随给药途径不同作用效果也不同。

1.2.2抗肿瘤作用

紫丁香苷有较强的机体习惯能力，鲜明加强了机体的抵抗力和抗肿瘤作用，同时自身没有毒副作用，较长时间的食用不会出现副作用和毒副作用等。日本研究人^[2]发现紫丁香苷对肿瘤的引导性触发以及转移和生殖等都有较为有效的压制作用。张敬一^[3]科研组精进了紫丁香苷对抑制动物肺部肿瘤生长扩散的作用，自此发现，紫丁香苷对肿瘤的扩散生长有较强的压制力。

1.2.3对心脑血管系统的影响

紫丁香苷原料含有的皂苷效用机制类似于人参，因此它被广泛应用到提高人体免疫力的配方中，特别有利于心脑血管。另外它还能被制成粉针减少心肌梗死范围，抑制强度与粉针使用多少成正比。它的注射制剂对骨髓微血管有积极的作用，巩固它的细小领域^[4],减少被放射破坏的动物微环境血红蛋白的含量，另外，紫丁香苷可以有效减弱高血脂的血小板凝聚。

1.2.4抗菌、抗病毒作用

一些人体正常菌群在紫丁香苷的影响下表现为压制作用。另外紫丁香苷可以大大改善肠道中菌群的工作能力^[5]。贺立人^[6] 通过紫丁香苷的注射制剂治疗烈性肝炎，随便选取适当数量的例子，建立对比发现紫丁香苷明显使临床的表现症状和副作用等出色于普通注射剂。更加表现出紫丁香苷即刺五加苷B在抗菌抗病毒方面的有效作用。

1.2.5 P-糖蛋白的抑制作用

紫丁香苷可以使得机体抗感染能力^[7]获得鲜明提高，与此同时紫丁香苷最鲜为人知的作用就是在肿瘤治疗方面对P-糖蛋白的显著抑制作用。P-糖蛋白主要是通过联并和水解ATP使得有效的肿瘤治疗药物被抑制出体外，而紫丁香苷恰好可以通过协同阿霉素的增效加大对P-糖蛋白的抑制，使得乳腺癌MCF-7细胞凋亡，表现出对P-糖蛋白的有效抑制。

1.3 P-糖蛋白

P-糖蛋白介导的MDR：P-糖蛋白即为MDR1编制成型的一种跨膜糖蛋白，它是鲜明的ABC转运蛋白超家族成员。同时它也是一个联合和水解ATP的药物外排泵，可以使水解流放出来的能量积极地将疏水亲脂性化疗药物输送出细胞，使得细胞里的药物浓度比杀伤浓度低，因此致使肿瘤细胞产生MDR

1.3.1 P-糖蛋白的作用机制

1. P-糖蛋白的ATP酶活性

由P-糖蛋白介入使得底物输送饱和，同时受到渗透压影响较大,必须利用ATP水解流放能量造成底物浓度分层。仔细发现,除去底物后的P-糖蛋白的ATP酶活性依旧出色于一般水平，从而告诉我们输送底物与ATP酶没有直接必须的联系，然而,与底物的联并可以增强ATP酶的活性^[8]。重要的一点，这种增强是双向进行的。某类物质在不同的浓度对ATP酶的影响是不同的，还有其他一类物质需要一定量的浓度才能对ATP酶起积极效应。而像维拉帕米这类药物在局限浓度下起到积极作用,一旦越过局限范围,活性就会迅速降低^[8]。

(2) P-糖蛋白由底物作用引起的构象改变

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