摘 要

民以食为天，食品中的有毒有害物质对人体健康会产生重大影响，食品安全一直都是人类关注的重大公共卫生安全问题之一。金黄色葡萄球菌是引起医院感染和细菌性食物中毒的一种主要病原菌。如何在保证高特异性、高灵敏度的要求下，快速、准确、可靠地检测出金黄色葡萄球菌具有非常重要的意义与价值。

本研究应用裸磁珠富集浓缩技术，从目标污染菌很少的样品中，快速分离出金黄色葡萄球菌，以集菌代替增菌培养。再结合新型荧光PCR技术，高效检测出目标污染菌。本实验通过比较不同吸附条件下裸磁珠对金葡菌吸附性能的影响，确定适合的吸附条件。结果表明，吸附前浓度为1.3×10⁵CFU/mL的5mL菌液，在磁珠用量20mg，水浴时间10 min，水浴温度37℃的条件下吸附效果较好，吸附率为99.62%。在进行荧光PCR定性检测时发现，磁珠吸附菌浓为10²CFU/mL金黄色葡萄球菌提取得到的DNA，能够满足荧光PCR扩增条件，被荧光PCR检测出来。本实验将金黄色葡萄球菌纯菌的检测（培养、吸附、荧光PCR定性）时间缩短为6 h，比起传统方法（总耗时2天左右），有效地缩短了定性检测金葡菌的周期。

关键词：金黄色葡萄球菌 裸磁珠 富集 PCR定性

Comparison and analysis of food borne pathogenic bacteria by naked bead method

Abstract

Food is the first necessity of the people.Toxic and harmful substances in food will have a major impact on human health.Food safety has always been one of the major public and safety issues of concern to humans. Staphylococcus aureus is a main pathogen causing nosocomial infection and bacterial food poisoning.How to quickly, accurately and reliably detect Staphylococcus aureus is of great significance and value under the requirement of ensuring high specificity and high sensitivity.

In this study, using naked magnetic beads enrichment and enrichment technology, Staphylococcus aureus was rapidly isolated from samples with few target bacteria, and bacteria collection was used instead of enrichment culture. Combined with the new fluorescence PCR technology, the target contamination bacteria can be efficiently detected. In this experiment, the effect of bare magnetic beads on the adsorption performance of S. aureus under different adsorption conditions was compared to determine suitable adsorption conditions. The results showed that the 5 mL bacterial solution with a concentration of 1.3×10⁵ CFU/ml prior to adsorption had a good adsorption effect at a bath volume of 20 mg and a bath temperature of 37℃. The adsorption rate was 99.62%. In the qualitative detection of fluorescent PCR, the DNA extracted from 10² CFU/mL of Staphylococcus aureus was found to be able to meet the fluorescence PCR amplification conditions and was detected by fluorescence PCR. In this experiment, the time for the detection of pure bacteria of Staphylococcus aureus (culture, adsorption, and fluorescence PCR qualitative) was shortened to 6 hours, which was significantly shorter than the traditional method (total time was about 2 days), which effectively shortened the cycle of qualitative detection of S. aureus.

Keywords: Staphylococcus aureus; bare magnetic; beads enrichment;

PCR qualitative

目录

摘要 II

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 食源性致病菌 1

1.2 金黄色葡萄球菌 1

1.3 浓缩富集手段 2

1.3.1 离心分离技术 2

1.3.2 膜分离技术 2

1.3.3 微流控芯片技术 2

1.3.4 磁珠法 3

1.4 食源性致病菌的检测方法及其现状 3

1.4.1 平板法 3

1.4.2 显色培养基法 4

1.4.3 聚合酶链反应技术 4

1.4.4 环介等温扩增技术 4

1.4.5 化学发光和磁性纳米技术 4

1.4.6 免疫磁珠法与荧光PCR结合 4

1.4.7 免疫磁珠法与酶联免疫吸附法结合 5

1.5 研究内容与意义 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验菌种 7

2.1.2 试剂 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 实验前期准备 8

2.2.2 接种并活化培养 8

2.2.3不同菌浓对吸附率影响实验 8

2.2.4 不同磁珠用量对吸附率影响实验 9

2.2.5 不同水浴温度对吸附率影响实验 9

2.2.6 不同水浴时间对吸附率影响实验 9

2.2.7 菌液的DNA模板的提取与测定 9

2.2.8 荧光PCR法定性检验 9

第三章 结果与讨论 11

3.1 不同菌浓对磁珠吸附性能的影响 11

3.2 不同磁珠用量对磁珠吸附性能的影响 11

3.3 不同水浴温度对磁珠吸附性能的影响 12

3.4 不同水浴时间对磁珠吸附性能的影响 13

3.5 DNA模板的检测结果 13

3.5.1 不同菌浓时DNA浓度与纯度结果 13

3.5.2 不同菌浓时PCR定性检测结果 14

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 食源性致病菌

致病菌是一类能在人体内寄生、增殖，引起重大疾病的细菌，也叫做病原菌。其中，食品的生产、运输过程中引入的一类病原菌被称为食源性致病菌。它们通过食品中的营养成分生长代谢引起食物的变质和腐坏，甚至分泌出有毒物质，是导致人罹患食源性疾病的推手之一^[1]。

由于自然环境、饮食习惯、食品贸易、食品加工方式等因素的改变，食品安全性降低，食品中毒现象愈加严重，食源性疾病的比例也在加重。因此，食源性疾病引起的食品安全是头号食品安全问题^[2]。为了改善食品安全，要迅速查明污染源和制定适当的措施以减少患病率和风险。《中华人民共和国食品安全法》要求参与生产食品的人员要具备健康证，每年都要进行健康检查和粪便检查，其中，食源性致病菌是重要的指标。

据WHO统计，每年全球范围内食源性或者水源性腹泻就致使220万多人死亡。在美国，食源性疾病每年的患病人数高达4800万人次、其中约达3000人次抢救无效，造成了至少6.5亿美元的经济损失^[3]。食源性疾病给人类造成巨大的健康和经济负担，关乎公共安全，危及社会的稳定，是人类关注的重大公共卫生安全问题。

1.2 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌。严重的中毒感染爆发事件，日本“雪印奶粉”事件，就是由金葡菌产生的肠毒素引起的，涉及一万四千多人中毒^[4]。传染源可能包括食品源头端受污染、加工人员携带致病菌、加工过程（设备仪器）污染、包装运输管控不严等多领域，可谓是无处不在，防不胜防。美国疾病控制中心相关报告表示，金黄色葡萄球菌中毒案例在所有的细菌性食物中毒案例中占33% ^[5]。

金黄色葡萄球菌是一种典型的革兰氏阳性菌，可分泌20多种毒性蛋白引起多种严重的微生物感染。该菌一般为球形，用显微镜可以观察到其形态呈葡萄串状，直径0.7~0.9μm，无鞭毛，大多无荚膜^[6]。该菌有很强的抗性，能在一定程度上抵抗重金属离子的机制作用，耐热性强，耐低温，耐高渗。在37℃~45℃，水分活度gt;0.99时，易在含淀粉和蛋白质的食品中产生肠毒素^[7-8]，目前，有文献报道了金黄色葡萄球菌已在奶酪、牛奶和肉等食品中引起食源性疾病的爆发^[9]。

1.3 浓缩富集手段

由于目标母体物质中待测组分含量很少，在痕量水平难以精确检测出来。为提高其含量至测定下限以上，通常采用富集浓缩手段，实现样品中低浓度微生物的检测分析^[10]。富集手段有离心分离技术、膜分离技术、微流控芯片技术、磁珠富集法等。

1.3.1 离心分离技术

霍秋爽^[11]通过分析离心分离机结构原理，改进参数设计，研究出一种新型高浓缩比富集系统，能够连续性大规模富集或者阶梯式富集直径5μm的微生物，可用于含有隐孢子虫和贾第鞭毛虫等微生物的水的净化。

1.3.2 膜分离技术

黄立坤^[12]通过膜分离技术，控制发酵的条件(pH和发酵时间）与分离工艺参数（压力与温度），以提高菌体的分离存活率和发酵活力。实验对乳酸菌菌体富集浓缩，并粗略估计出活菌数变化趋势，使得菌体分离存活率达90%。陈军红^[13]利用超滤膜富集病毒，其截留率可达100%。富集后的病毒用双层琼脂法检测，检测限为10PFU/ml。这种孔径极小的超滤膜可以应用于生物实验室或传染病房的空气循环系统中。

1.3.3 微流控芯片技术

汪志芳^[14]采用脂纳米颗粒作为一种拟稳态相，使用微制造的通道腔室结构来操纵流体。从而抑制E.coli在通道聚集和吸附，在微流控芯片上超灵敏检测低浓度大肠杆菌，其检出限为145CFU/ml。该方法将目标母体物质中待测组分含量很少，在痕量水平水平的菌精确检测出来，具有实验操作简便、样品用量少、实验用时短等优点，可以在药物的筛选、环境的监测、医学检验以及生物化学等领域广泛应用。

1.3.4 磁珠法

磁珠法又分为裸磁珠法和免疫磁珠法，目前在生物大学科中（如医药类、生物细胞学、微生物学）广受欢迎^[15]。裸磁珠利用其磁响应性、超顺磁性以及生物相容性能等良好吸附性，活化结合丰富的表面功能基团，是一种应用广泛的纳米级化学合成材料^[16]。免疫磁珠技术在基因纯化、细胞纯化与微生物富集等方面利用广泛，免疫磁性清除的方便性和可重复性为复杂基质中残留物质分析提供了高价值的新方法。其原理是利用磁珠与抗体结合形成免疫磁珠，然后与反应介质中的特异性抗原结合形成稳定的抗原－抗体复合物。该物质在外加磁场下定向移动，从而能够分离特定抗原。