摘 要

四氢嘧啶（Ectoine）是环状氨基酸衍生物的其中一种，由于其在渗透压调节，给各种微生物细胞供能和保护细胞及大分子物质的独特作用，过去一段时间 它在酶工业和医疗领域都有越来越广泛的应用。当前采用发酵中度嗜盐微生物的生产四氢嘧啶方法的缺点是设备损耗较大、生产成本高。针对这一问题，开发大肠杆菌代谢工程菌生产四氢嘧啶的工艺显得尤为重要，本文以一株重组大肠杆菌E. coli MG1655（PTrc-ectABC) 为生产菌株，开展发酵罐上生产条件的研究，主要通过单因素实验的方法，优化大肠杆菌发酵过程中补料策略、接种量、初糖浓度等条件，最终得到15%接种量、初糖浓度15g/L、先分批后流加的补料方式下四氢嘧啶产量最高，为15.80g/L。

关键词：四氢嘧啶 重组大肠杆菌 发酵条件优化

Optimization of fermentation tank conditions for Ectoine

Abstract

Ectoine is one of the cyclic amino acid derivatives. Because of its osmotic pressure regulation, it provides unique functions for the supply of various microbial cells and protects cells and macromolecules. It has been in the enzyme industry for some time. The shortcomings of the current method for producing Ectoine using fermented moderately halophilic microorganisms are large equipment losses and high production costs. In response to this problem, it is particularly significant to develop a process for the production of Ectoine by E. coli metabolic engineering bacteria. In this paper, a recombinant Escherichia coli E. coli MG1655 (PTrc-ectABC) was used as a production strain to study the production conditions on the fermenter. Mainly through the single factor experiment method, optimize the feeding strategy, inoculum amount, initial sugar concentration and other conditions in the fermentation process of E. coli, and finally get 15% inoculation amount, initial sugar concentration 15g/L, first batch and then fed The highest yield of Ectoine was 15.80 g/L.

Key Words: Ectoine ;Escherichia coli; fermentation conditions optimization;

目录

四氢嘧啶发酵罐上条件优化 I

摘要 I

Abstract II

第一章：文献综述 1

1.1四氢嘧啶介绍 1

1.1.1四氢嘧啶的基本性质 1

1.1.2四氢嘧啶的合成途径 1

1.1.3四氢嘧啶的工业用途 1

1.2大肠杆菌发酵条件优化概述 2

1.2.1补料方式 2

1.2.2初糖浓度 2

1.2.3 接种量 2

1.2.4溶氧浓度 3

1.2.5温度 3

1.2.6 PH 3

1.2.7诱导剂 4

1.3研究思路 4

1.4四氢嘧啶发酵罐上条件优化的意义 5

第二章：实验内容 6

2.1实验材料 6

2.1.1菌株 6

2.1.2主要仪器设备 6

2.1.3主要培养基 6

2.2实验方法 7

2.2.1菌种活化培养 7

2.2.2发酵罐预处理 7

2.2.3发酵罐上罐发酵 7

2.2.4四氢嘧啶产量测定 8

第三章： 实验结论 9

3.1不同接种量实验结果 9

3.2不同初糖浓度实验结果 11

3.3不同补料方式 14

第四章：结论与展望 18

4.1结论 18

4.2展望 18

参考文献 19

致谢 21

第一章：文献综述

1.1四氢嘧啶介绍

1.1.1四氢嘧啶的基本性质

四氢嘧啶（Ectoine，又名1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸），分子式：C6H12N2O2,沸点：125℃（115mmHg），相对分子量：142.16^[1]。它是一种极性、易溶、生理pH范围不带电的环状氨基酸衍生物，可以在不损害细胞正常生理功能的前提下稳定细胞膨胀压力，并且可以减轻如高渗透压，高温度，冻融，脱水，辐射和化学试剂对蛋白质，核酸，生物膜和整个活细胞的毒性作用，这被称为高效灵敏的调节。大量被发现于中度嗜盐微生物的体内^[2]。

1.1.2四氢嘧啶的合成途径

四氢嘧啶的合成途径是1990年在Halomonas elongata中通过C13同位素标记发现的^[2]。如围所示，四氢嘧啶的合成途径是天冬氨酸代谢支路的一种，从L-天冬氨酸-4-半醛开始进入专属路径，在ect A、B、C基因编码的三种酶催化下，经三步反应合成四氢嘧啶^[3]。

图1.四氢嘧啶的合成路径

最初，人们采用化学合成、天然提取等方法生产四氢嘧啶，但化学合成的步骤繁琐复杂且需要使用有毒的化学试剂，而四氢嘧啶在天然微生物体内含量极低。目前，四氢嘧啶的主要生产途径是采用高浓度盐分批流加补料发酵中度嗜盐微生物的方法即微生物发酵法^[3]。该方法有一定的缺点，主要表现为高浓度盐对生产设备的损耗和中度嗜盐微生物存在生长慢、发酵周期长、产率低的问题。

1.1.3四氢嘧啶的工业用途