1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.1 脂肪氧合酶的简介

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12），又称脂肪氧化酶，属于氧化还原酶属，分子质量范围一般在90 000-100 000之间。球形、无色、可溶，等电点范围为pH5.7~6.2[1]，是一类含非血红素铁、不含硫的过氧化物酶，能够专一的催化具有cis，cis-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，通过分子加氧，形成具有共轭双键的多元不饱和脂肪酸的氢过氧化衍生物[2，3] 。LOX酶蛋白由多个肽链组成，其金属辅基的活化态为氧化性三价铁离子，非活化态为二价铁离子，并通过Fe2 与Fe3 的循环实现其催化功能。

在自然状态下脂肪氧合酶有三种存在形式：(1)无色酶，铁离子处于二价，此时酶无活性；(2)黄色酶，此时氢过氧化物将活性中心的二价铁离子氧化成三价铁离子，酶具有活性；(3)紫色酶，当氢过氧化物过量出现时出现，这种情况下酶性质不稳定，室温下数分钟转变为黄色酶[4]。

不同来源的LOX的纯化条件、酶学特性不同，发挥的生理功能也不同。在植物体内，LOX对植物体内衰老过程发挥着重要作用[5]，它可以直接作用于膜脂，催化不饱和脂肪酸的氧化反应，从而导致膜脂氧化促进组织衰老。在动物体内，LOX催化花生四烯酸发生过氧化反应，代谢产物是一些炎症介导物质，如白三烯、前列腺素的形成等氧化脂质。LOX还具有网状细胞膜降解、癌细胞和肿瘤细胞转移机制的作用。此外，LOX催化不饱和脂肪酸中cis，cis-1，4-戊二烯结构，通过加氧反应，形成氢过氧化物。这些氢过氧化物被认为是风味的前体物质，能经历二级酶反应，转化为醛、酮等挥发性化合物。这些物质对食品的感官特性有着较大的影响。

1.2 脂肪氧合酶的结构

研究发现，LOX的来源不同，其氨基酸序列也有所不同，但三维结构上均呈球状[6]，其多肽链含有672-673个氨基酸残基[7]。在真核生物中参与不饱和脂肪酸的代谢，且在动植物不同发育阶段存在不同的类型。LOX的活性中心结构使得它对于底物有特异性要求，其抑制剂根据来源可分为人工合成的以及天然提取物，其抑制机理包括与底物竞争酶的活性部位、螯合作用、还原作用和竞争脂质自由基[10]。

脂肪氧合酶的催化过程目前存在很多种的理论，自由基理论最为广泛接受。首先，氢原子从底物上离开，Fe3 被还原。Borowski[11]等通过混合密度功能理论的研究证明了氢原子的这一次转移过程，同时发现这一步是最困难的一步，所需的活化能为12.1kcal/mol，反应焓约为12.6kcal/mol。Scarrow[12]等认为转移的氢是被LOX活性部位的铁离子相连的羟基组份接受。其次，分子氧与底物自由基反应，形成氧化自由基，在此过程中有可能伴随O2 转变成O2- #183;自由基。最后氧化自由基被LOX中的Fe2 还原，生成氢过氧化物，而LOX中的Fe2 氧化为Fe3 ，重新转化为了活性态。

LOX的催化反应底物都是含有cis，cis-戊二烯结构的不饱和脂肪酸、脂肪酸酯。在植物中天然底物主要是亚油酸和亚麻酸，而在动物体内底物主要是花生四烯酸。在亚油酸和亚麻酸上的加氧位置是C9和C13，而在花生四烯酸上的加氧位置主要为C5、C12和C15，也可以在C8、C9和C11上加氧。LOX的来源不同 ,底物的不同 ,都会导致其加氧的位置有所不同 ,因而产物也就有所不同。LOX- 1的底物为不饱和脂肪酸 ,生成 13-氢过氧化合物 ,LOX- 2的底物为酯化底物，生成9-或13-氢过氧化合物[10]。在低温（0～5℃）下，仅LOX-1起作用。

1.3 LOX酶的提取纯化方法

1.3.1 LOX酶的提取方法

大多数植物的LOX主要是胞液酶，即呈可溶性状酶。但实验证明，除此之外，LOX还存在于液泡、线粒体及质膜上，即膜结合酶。因此，在考虑从某种原理中提取LOX时，要先确定所要提取的是水溶性LOX还是膜结合LOX，这对减轻后续纯化工作具有重要意义。

1）水溶性LOX

　　按一定比例加入适当的缓冲液，搅拌或者研磨，使水溶性成分提取出来，然后经过过滤、离心等步骤得到粗酶液。

2）膜结合LOX

膜结合蛋白，则常常在缓冲液中加入非离子去垢剂，以促进膜结合蛋白被充分地溶解出来。非离子去垢剂对蛋白质作用温和，能有效保持膜蛋白的生物活性，因此常用于膜蛋白的分离与纯化

1.3.2 酶的纯化方法

主要的纯化方法包括：

1）（NH4）2SO4盐析

盐析法是比较古老的方法，但目前仍广泛采用。它根据酶和杂蛋白在高浓度盐溶液中的溶解度差别进行分离纯化。最常用的盐就是硫酸铵。二次盐析法是用较低盐浓度除去杂蛋白，再用较高盐浓度进行分离纯化。盐析法的优点是简便、安全、重现性好；缺点是分辨率低、纯度提高不显著。

2）离子交换

离子交换法是液相中的离子和固相中离子间所进行的一种可逆性化学反应，当液相中的某些离子较为离子交换固体所喜好时，便会被离子交换固体吸附，为维持水溶液的电中性，所以离子交换固体必须释出等价离子回溶液中。

3）凝胶过滤

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

4）疏水层析

疏水层新利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。

5）共沉淀法

共沉淀法利用离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠、非离子型聚合物如PEG等，在一定条件下能与蛋白质直接或间接地形成络合物，使蛋白质沉淀析出；然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化目的。

1.3.3酶的活力测定

各种方法的测定原理各不相同，也具有各自的优缺点，如表2所示[13 14]。

1.4 研究的目的和意义

脂类的分解氧化和风味物质形成关系密切，通常认为不同肉的特征性风味来自脂肪，特征香味道产生与脂类分解氧化的开始是一致的，脂类氧化分解是形成特征风味的必要条件，其产物再与美拉德反应产物相互作用，对风鸭整体作用重大[15]。由于鸭肉脂类不饱和脂肪酸含量 较高，在加工中脂类氧化和降解程度较为剧烈，所以其对风鸭成品特征香味贡献可能更大。因为脂肪氧合酶对于动物性食品风味的形成起着一定的作用，所以如何利用脂肪氧合酶来修饰或者改变产品的风味，提高产品的期望值是LOX值得继续研究的领域。

1.5 参考文献

[1]Hidebrand D F. Lipoxygenase

[J]. Physiologia plantarum, 1988,76:249-253.

[2]刘明丽，余俊红，娄晓红等. 脂肪氧合酶及其对啤酒风味稳定性的影响 [J]. 酿酒科技，2011，5：98-102.[3] Watanabe K, Ishikawa C, Ohtsuka I, et al. Lipid and Fatty Acid

Compositions of a Novel Docosahexaenoic AcidProducing Marine Bacterium[J]. Lipids, 1997, 32: 975-978.

[4]陈晶，李正国.　脂氧合酶在果实成熟衰老中的作用

[J].广州食品工业科技，2002，18（1）：50-53.

[5] B.Dave Oomah,Edward O.Kenaschuk,and Giuseppe Mazza,Lipoxygenase Enzyme in Flaxseed

[J].J.Agric.Food Chem,1997,45:2426-2430

[6] Gillmor S AVillasenor A,Fletterick R,et al. The structure of

mammalian 15lipoxygenase reveals similarity to the lipases and the

determinants of substrate specificity

[J].Nat.Struct Biol.,1997(4):1003-1009.

[7]Radmark O,Arachidonate 5-lipoxygena

[J].Prostag oth Lipid M,2002(68):211-234[8] Alan R B. Lipoxygenases: Occurrence, Functions, Catalysis, and

Acquisition of Substra[J]. The Journalof Biological Chemistry, 1999, 274 (34): 23679-23682.[9] Catalytic Reaction Mechanism of Lipoxygenase. A Density Functional Theory Study[J]. J.Phys.Chem.B 2003,107,4639-4646.

[10]何婷，赵谋明，崔春等. 脂肪氧合酶的酶学特性及其活性抑制机理的研究进展

[J].食品工业科技，2008，29：291-298.[11] Borowski T, Broclawik E. Catalytic reaction mechanism of lipoxygenase: a density functional theory study[J]. J Phys Chem B, 2003, 107: 4639-46461.

[12]Scarrow R C, Trimitsis M G, Buck C P, et al. X #8212; ray Spectroscopy of the iron site in soybean lipoxygenase-1: changes in coordination upon oxidation or addition of methanol[J]. Biochemistry, 1994, 33 (50): 15023-150351.

[13]钟芳，王璋，许时婴. 3种脂肪氧合酶酶活测定方法[J].无锡轻工大学学报，2001，20（1）：77-81.

[14]李彩凤，赵丽影，陈业婷等. 高等植物脂氧合酶研究进展[J].东北农业大学大学学报，2010，41（10）：143-149.

[15] 戚巍威，徐为民，徐幸莲等. 传统风鸭加工过程中脂肪水解和氧化的研究[J].食品与发酵工业，2008，34（1）：35-38.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1 主要研究内容

（1）鸭肉中脂肪氧合酶粗酶的分离；（2）粗酶液的纯化； （3）脂肪氧合酶性质研究；

2.2 研究手段