文 献 综 述

1.植物蛋白肽

我国一直有利用植物蛋白的传统,不仅仅是植物蛋白资源来源丰富， 具有产量高、 价格低的优势， 通过酶法水解植物蛋白制备植物蛋白肽粉， 符合现代食品生物工业的发展要求， 具有广阔的应用前景。而且研究发现植物蛋白酶解物及其生物活性肽类物质， 不仅能作为氨基酸供体， 在体内具有优良的消化吸收性能， 也是一类生理调节剂， 在体内参与机体免疫调节、 降血压、 促进矿物质吸收、 抗血栓等。在国内植物蛋白源活性肽研究进展分别从大米、玉米、小麦以及大豆蛋白肽的发展利用做了较为详细的综述^[1]。而国外关于蛋白酶解物和活性肽产品的研究开发极为活跃， 越来越多的生物活性肽已被发现、 分离并确定结构^[2]。日本以活性肽为功能因子， 已开发了各种低抗原食品、 婴儿食品、 流动食品、 运动食品、 促钙吸收食品、 降压食品、 醒酒食品等一系列的产品， 取得了良好的社会效益、 经济效益。

而对于怎样从植物的中提取出蛋白肽一直是近年来研究的热点。随着分离、纯化等技术的飞速发展，人们通过分离提取法、化学合成法、重组DNA法、水解法等方法^[3]，越来越多的具有特定生物活性和药用价值的肽类化合物从天然植物中分离得到。本研究就是利用酶解的方法从豌豆中提取蛋白肽。

2．豌豆

豌豆含有钾、钙、亚硝胺分解酶、镁 、胡萝卜素、维生素Ｂ1、维生素E 、止杈素、 赤霉素Ａ20 、 植物血凝素等多种特殊成分^[4-5]。淀粉含量约为 50% ，蛋白质为 20%～24%，脂肪为 1%～2.7%，还有大量的微量元素和维生素 。干豌豆中膳食纤维和淀粉含量非常高，其成熟籽粒中分别含有蛋白质21%～28%和淀粉 48%～52%。而大豆的蛋白质含量^[6]为35%～44%，脂肪25%～20%糖类20%～30%，水分8%～12%，纤维素和矿物质各为4%～5%，几乎不含淀粉。另外一中我国主要的农作物花生，其是我国主要的油料作物，种子（花生仁）内富含脂肪和蛋白质，其含油率一般高达50%左右，比大豆高近一倍。其脂肪为35%～56%，蛋白质24%～30%，糖类13%～19%，粗纤维2.7%～4.1%，灰分2.7%。

对于大豆和玉米作为油料作物的应用相对较高，而豌豆可作主食，磨成粉可制作糕点、 豆馅、 粉丝、 凉粉、 面条、 风味小吃等；其嫩荚和嫩豆粒可菜用也可制作罐头^[7-8]。豌豆蛋白是优良的可食用植物蛋白 。利用豌豆蛋白制成的面制品、 肉制品、 饮品、 方便食品、 冷冻食品、 调味汁等皆有很高营养价值，且质量优良，味道鲜美。豌豆制品可作为一种脂肪代替品应用于食品中，其高淀粉含量，中等蛋白质含量，低水分，几乎不含油脂，且有降血糖、预防慢性病等功效，是一种很有潜力的功能性食品。此外配料以豌豆为原料加工的产品^[9]主要有豌豆淀粉、 豌豆蛋白、 豌豆膨化粉、 油炸豌豆、 青豌豆罐头和豌豆豆奶等。代表性的食品有豌豆糕、 豌豆黄、 豌豆烧豆腐、 翡翠煎饼 、 猪肝豌豆苗营养汤 、 虾仁杏仁炒豌豆等。在现代新开发豌豆食品有豌豆啤酒；风味豌豆即食罐头 ；豌豆酸奶 ；豌豆豆腐 ；豌豆酸凝乳等。另外豌豆苗膳食纤维（﹤15%）对防止面包老化^[10]有积极意义，同样的豌豆多糖可代替果胶广泛应用于食品工业中。

3.豌豆蛋白肽的研究现状

3.1提取工艺

制备豌豆肽的三种途径^[11]：一是从富集活性肽的植物或微生物中提取获得, 二是通过化学方法( 液相或固相) , 酶法, 重组 DNA技术等方法合成, 三是消化过程中产生的或体外分解完整蛋白质产生。

3.1.1化学合成法

根据目标肽的氨基酸排列顺序,用人工方法进行化学合成, 此技术难点是目标肽的氨基酸排列顺序要弄清楚,虽然目前已经成功地合成了近百个氨基酸残基构成的多肽，但是生产过程复杂, 成本高,在工厂加工中相对使用的较少。但其在医药方面却有着很好的研究前景，尤其是固相合成法^[12]。而我国, 在1 9 5 8年成功合成了具有生物活性的 8肽-催产素。

3.1.2提取法

制备天然活性肽通常采用溶剂提取法， 即将生物材料浸泡在适当的缓冲液中， 使生物活性肽充分溶解， 然后通过离心的方法除去不溶部分， 再通过调节溶液 pH 值或者加入蛋白质变性剂使蛋白质沉淀， 最后通过离心的方法除去蛋白质等杂质， 对获得的活性肽粗提液经分子筛层析等手段进行分离纯化，获得目标活性肽 Rizzello C^[13]等利用溶剂提取法制备奶酪活性肽。

3.1.3化学水解法

主要是酸水解法, 多是利用些酸使蛋白中的肽链断裂,由于不同的氨基酸其肽键合成力有差异,所以蛋白质中结合力小的键先断开, 形成长短不同的肽链, 此方法简单, 成本低, 但无法对水解过程进行有效控制, 不断按设定的水解度进行, 氨基酸会受到损害, 降低蛋白营养价值, 而且水解结束需将盐酸除去。通过酸水解的方法提取蓖麻饼粕中的氨基酸能够更好的利用其中的氨基酸资源^[14]，并且可将蓖麻饼粕中所含所有毒物全部破坏。

3.1.4酶解法

采用蛋白酶在最适温度和 p H值条件下进行酶解反应这种方法是在比较温和的条件下进行的, 能较好地控制生产, 并且保存氨基酸的营养价值, 较典型的制备方法。

蛋白质的酶解主要是指酶^[15]作用于肽键，使蛋白质逐渐降解为多肽、二肽直至游离氨基酸。内切蛋白酶(如木瓜蛋白酶)可以将蛋白质从肽链中部切断，水解速度较快，水解液苦味较小，但最终氨基态氮得率低，且风味较差；外切蛋白酶(如风味酶)可以将蛋白质从肽链氨基末端切断，实现蛋白质在一定水解度下的定向水解，生成单个氨基酸，氨基态氮得率高，成为不同风味的前体物^[16-18]。酶的恰当使用以及酶解参数的正确选择对产品的质量有着重要影响，因此需要对不同的原料选择适当的酶及酶解条件进行大量深入的研究。下面就是最为常见的几种酶的性质特点。

复合蛋白酶是一类混合的酶

碱性蛋白酶是由地衣芽孢杆菌发酵而得的一种内切酶，催化丝氨酸。PH为9----11，最适温度为：40℃---55℃。

A．S1398中性蛋白酶又名枯草杆菌蛋白酶，其为褐色颗粒，浅棕褐色粉末或液体，易溶于水，PH在7.0到8.0条件下37℃比较稳定，2h酶存活率为80%，45℃以上酶活力不稳定，60℃以上很快失活。最适作用温度为45℃到55℃，最适作用PH5.5#8212;7.5。37℃条件时，最适作用PH为6.8到8.0，可被EDTA、磷酸盐及Cu、Hg、Al离子所抑制，被Mn、Ca、Mg离子激活。微生物生产的中中性蛋白酶#8212;分子酶中含有一个原子锌，相对分子质量为35000至40000，等电点8到9.在微生物蛋白酶中，枯草杆菌蛋白酶最不稳定，易自溶，使相对分子质量明显减少，钙离子对酶的热稳定性有保护作用。

木瓜蛋白酶是#8212;SH基蛋白酶，其商品名为木瓜酶。--SH基酶是酶蛋白中含有半胱氨酸残基、巯基（--SH）的酶，巯基是酶活力表现必不可少的基团。木瓜酶为白色至浅棕黄色无定形粉末或液体，有一定吸湿性；溶于水或甘油，水溶液无色至淡黄色，有时是乳白色，几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。由木瓜制备的商品酶制剂中含有三种酶，因此木瓜酶是一种混合酶。木瓜蛋白酶主要作用是对蛋白质有极强的加水分解能力，特异性较广，肽链的C末端有精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、酪氨酸残基者均能切断，最适PH为5.0至7.0，最适作用温度65℃，在中性或弱碱性时亦有作用。有耐热性，50至60℃时可正常使用，90℃时不会完全失活。

3.2酶解蛋白肽的应用

生物酶解技术^[19-22]应用于人类健康、农业、工业与环境，在其它领域也有一些应用，应用范围广阔。在人类健康领域的应用最多，已经成功形成生产力用于人类健康工程。近年来酶解技术被充分运用到中药提取中，因为酶具有专一性和高效性，采用不同种类的酶可以最大程度使药材中的有效成分溶出， 同时对无效成分的溶出扩散进行阻止。这样在很大程度上使有效成分的溶出效率得到提高， 以此保障药物提取后续工作的正常高效运转。此外，由于环境污染，资源短缺一直是全球性的热点话题，而如何解决更是迫不及待的问题，因而对于海洋资源的探索是必须的。海洋生物中不但蛋白质含量丰富，而且在长期特异闭锁环境中蛋白质的组成、结构和功能与陆地动植物有较大的差异，因此是生产功能性肽很好的特定的蛋白资源^[23-24]。日本、欧美等国把海洋生物中功能性肽系列产品的研究与开发作为发展海洋保健食品和药物的一个重要方向，并取得了丰硕的成果。

4.酶催化反应的关键影响因素

酶促反应动力学^[25-29]是研究酶促反应速率及其影响因素的科学影响酶催化反应的关键因素主要有反应体系的温度、液料比、反应时间、金属离子等。

(1) 温度

在一定的范围内，温度升高，均相反应速度随之加快，但超出某一温度时，又促进酶蛋白的变性反应，使催化能力降低。因此，酶催化反应均有一个最适温度范围。

(2) 液料比

在酶催化反应时，并不是液料比越小越好，当底物浓度一定时，一定范围内增加液料比可以提高底物的转化率，增加产量。考虑到产物的生成量及其在料液中的浓度，液料比不能太高。

(3) 反应时间

在酶催化反应时，酶解时间太短，酶解不充分，影响产物的收率，时间太长，酶解液易腐败，并且增加了保温操作成本。因此控制反应时间就显得很重要。

(4)金属离子

适量的金属离子有利于提高酶的活力和稳定性。相反，过剩的金属离子会破坏酶蛋白的二级结构及活性中心，降低酶活。Zn² 在离子浓度低于1mmol/L时，对淀粉酶有激活作用，而当浓度高于2.5mmol/L时，有抑制作用^[30]。在Ca² 浓度低于10mmol/L的浓度范围内，酶活力随着Ca² 浓度的增加而增高，当浓度达到10mmol/L时酶活力最高，而当浓度高于10mmol/L时，有抑制作用^[31]。

5.研究目的及意义

本研究的目的，通过酶解制备豌豆蛋白肽的动力学研究，提高制备豌豆蛋白肽的方法，从而可以开发和利用豌豆蛋白肽的功能价值。

本实验的意义在于通过酶解的方法有效的降低成本，最大程度的保持豌豆蛋白肽的完整性，从而可以更好的运用蛋白肽的相关功能，使其研究更能为研发新产品做好基础，为豆类蛋白肽的研究开发奠定基础。本研究以豌豆为原料， 通过酶解技术制备肽， 并进行各项指标分析、 营养学评价， 以获得高质量植物蛋白肽粉。酶解制备的植物蛋白肽粉可应用于营养补充剂、 食品添加剂以及天然日化等领域。

参考文献

[1]张美莉, 侯文娟, 杨立风. 植物蛋白源生物活性肽的研究进展[J]. 中国食物与营养, 2010 (011): 33-36

[2] 杨玉英, 王伟, 张玉, 等. 天然蛋白源降血脂活性肽的研究进展[J]. 浙江农业科学, 2013 (9): 1157-1162.

[3] 岑怡红, 方俊, 李宗军, 等. 制备活性肽的主要方法研究[J]. 现代农业科技, 2007 (12S): 151-151.

[4]蔡琳雅, 李友杰, 刘慧, 等. 豌豆营养价值探析[J]. 宁夏农林科技, 2013, 54(7): 71-72.

[5]闫晓玲, 王鸿斌, 杜新源, 等. 香豌豆营养成分分析[J]. 草原与草坪, 2003 (3): 55-57.

[6]食品原料学[M]. 东南大学出版社, 2007.

[7]张乾元, 韩冬, 李铎. 黄豌豆营养成分和功能研究进展[J]. 食品科技, 2012 (6): 141-144.

[8]柳春光. 豌豆制品的研究与应用 [D][D]. 江南大学, 2008.

[9]莫重文. 豌豆蛋白及淀粉的制取研究[J]. 郑州粮食学院学报, 1999, 20(4): 84-88.

[10]明建, 宋欢, 赵国华. 豌豆苗膳食纤维的添加对面团和面包物性的影响[J]. 食品科学, 2008, 29(10): 67-70.

[11]郝晓霞, 罗明, 余淑娴. 酶解技术及其应用[J]. 江西科学, 2007, 25(3): 355-358.

[12]张少斌, 张力, 梁玉金, 等. 生物活性肽制备方法的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2011 (6): 39-41.

[13]石伟，王琦，张俊君，陈五岭，生物活性肽SSID固相合成工艺的研究.现代生物医学进展，2008（3）:462-464

[14]苏雅拉图，陈宇杰等，蓖麻饼粕提取氨基酸及酸水解法优化初探，食品工业科技，2014（3）:192-194

[15] 郝利平. 食品添加剂 [Ⅳ [][J]. 2004.（12）：252-270

[16] 腾用雄, 张曰富, 腾用庄. 酶解技术及其在咸味香精生产中的应用[J]. 福建轻纺, 2010 (011): 35-37.

[17]蒲首丞, 王金水, 王亚平, 等. 复合蛋白酶水解谷朊粉制备生物活性肽的研究[J]. 食品科技, 2005 (4): 23-25.

[18] 宋成英. 酶解技术在中药提取中的应用研究[J]. 时珍国医国药, 2013, 24(8): 1934-1935.

[19]孙婧, 顾林. 谷物蛋白质制备活性肽研究进展[J]. 粮食与饲料工业, 2007 (9): 17-19.

[20]程谦伟, 刘昭明, 孟陆丽, 等. 碱性蛋白酶水解制备赤豆蛋白肽的工艺研究[J]. 粮油加工, 2010 (2): 43-45.

[21]孔祥珍, 华欲飞, 张彩猛. 酶法水解制备植物蛋白肽粉的研究[J]. 中国油脂, 2013, 38(1): 16-19.

[22]杜翠荣, 马荣山. 酶解高水解度大豆蛋白肽的研究[J]. 粮油加工与食品机械, 2005 (6): 57-59.

[23]林伟锋, 姚毓才. 应用酶解技术开发利用海洋食品资源[J]. 食品工业科技, 2002, 23(11): 90-91.

[24]董瑞晨, 王深旗, 熊华, 等. 米渣蛋白肽的新型酶解工艺及产品结构表征[J]. 食品工业科技, 2013, 34(4): 137-139.

[25]陶学明, 王泽南, 余顺火, 等. 碱性蛋白酶酶解梭子蟹蛋白动力学模型研究[J]. 食品科学, 2009 (23): 252-254.

[26]彭志英, 陈中, 龙彪, 等. 酶解法制备乌鸡蛋白肽的动力学研究[J]. 华南理工大学学报, 2006, 34(12): 55-58.

[27]辛愿, 肖志刚, 肖睿, 等. 菜籽粕蛋白肽制备工艺条件优化[J]. 东北农业大学学报, 2009, 40(12): 101-106.

[28]Silvestre M P C, Silva M C, Souza M W S, et al. Hydrolysis degree, peptide profile and phenylalanine removal from whey protein concentrate hydrolysates obtained by various proteases[J]. International Journal of Food Science amp; Technology, 2013, 48(3): 588-595.

[29]Sun X D. Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilisation[J]. International Journal of Food Science amp; Technology, 2011, 46(12): 2447-2459.

[30] 胡毅, 潘鲁青. 10种金属离子对三疣梭子蟹中肠腺消化酶活性的影响[J]. 热带海洋学报, 2006, 25(6): 52-57.

[31] 赵飞. γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系[D]. 山东农业大学, 2008.