论文总字数：16956字

摘 要

植酸酶(E.C.3.1.3.8)是催化植酸及其盐类水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称。磷是动物体内一种必需的矿物质，在参与体内正常的新陈代谢中起着重要的作用。大量研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，从而可以减少饲料中磷的添加量，这对提高畜牧生产效益及降低环境污染有重要意义。

本研究是以产植酸酶的毕赤酵母工程菌为生产菌种，首先在摇瓶水平上，采用单因素试验和L₁₈（3⁷）正交试验考察不同工艺条件对产酶活性的影响。结果表明影响重组毕赤酵母产植酸酶的因素重要性依次为：诱导时间＞甲醇添加量＞装液量＞初始诱导pH＞生长时间＞接种量＞初始生长pH，产酶最佳条件为：接种量为 3%（V/V）、装液量为 8%（V/V）、生长时间为 20 h，诱导时间为 120 h，甲醇添加量为 1.5%（V/V）、生长pH为 6.00，诱导pH为 5.00。接着以摇瓶发酵得到的优化工艺条件为基础，在5 L发酵罐中进行了放大试验，其所产植酸酶酶活可达 40000 U/mL以上。

关键词：植酸酶 毕赤酵母 优化 高密度发酵 酶活力

A study for the fermentation process of genetic engineering phytase

Abstract

Phytase(E.C.3.1.3.8) is one kind of enzyme which can catalyze phytic acid (inositol hexaphosphate) and phytic acid salt hydrolyzing into inositol and phosphoric acid (phosphate). Phosphorus is the animal’s necessary mineral, playing an important role in the normal metabolism. A mass of research indicated that adding the phytase in pigs and poultry diet not only can increase the utilization of phosphorus to 60%, but also can decrease the discharge quantity of phosphorus in feces to 40%. It can reduce the amount of adding phosphorus in feed. It’s very important to improve the efficiency of livestock production and reduce the environment pollution.

At the first, the effects of the inoculum, liquid volume, growth time, induction time, methanol concentration, initial growth pH value and initial induction pH value on expression of phytase in recombinant P.pastoris H311were investigated by single factor test and L₁₈（3⁷）orthogonal test, and the enzymatic properties of recombinant phytase were analyzed. In the order of importance to expression of phytase in recombinant P.pastoris, the influencing factors were induction time, methanol concentration, liquid volume, the initial induction pH value, growth time, inoculum and initial growth pH value. The optimal inoculum, liquid volume, growth time, induction time, methanol concentration, initial growth pH value and initial induction pH value were 3%（V/V）、8%（V/V）、20 h、120 h、1.5%（V/V）、6.00 and 5.00 respectively. Then, On the basis of the above studies, high density cultivation condition of recombinant yeast was explored in a 5-L fermenter. The phytase activity can reach more than 40000 U/mL.

Key words: Phytase；Pichia pastoris；Optimization；High-density fermentation；Enzyme activity

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文 献 综 述 2

1.1 植酸酶性质及研究状况 2

1.2 毕赤酵母高密度发酵的简介 3

1.3 植酸酶的研究意义 3

第二章 实验与结果讨论 5

2.1 主要仪器和试剂 5

2.1.1 主要实验仪器 5

2.1.2 主要实验试剂 5

2.1.3 培养基配方 6

2.1.4 植酸酶酶活测定试剂配制 7

2.2 摇瓶发酵试验方法 8

2.2.1 实验菌种 8

2.2.2 摇瓶发酵培养方法 8

2.2.3 5 L发酵罐高密度发酵 8

2.2.4 菌体密度测定方法 9

2.2.5植酸酶粗酶液酶活测定 9

2.3 结果与讨论 11

2.3.1无机磷标准曲线 11

2.3.2 毕赤酵母工程菌产植酸酶的摇瓶发酵工艺研究 12

2.3.3 5L发酵罐高密度发酵工艺研究 16

第三章 结论与展望 18

3.1 结论 18

3.2 展望 18

参考文献 19

致 谢 21

第一章 文 献 综 述

1.1 植酸酶性质及研究状况

植酸酶属于磷酸单酯水解酶,是一类特殊的酸性磷酸酶,它能水解植酸和一些有机磷化合物。植酸酶来源广泛，包括植物、动物和微生物，尤以微生物来源的植酸酶最为广泛，但自然界微生物中植酸酶的含量很低，远低于工业生产需要^[1]，同时饲料用酶加工需要经过一个高温(75～93 ℃)制粒过程，一般的植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失；另一方面，植酸酶的作用部位是动物胃肠道，动物胃肠道的温度一般是37 ℃，pH为2.5～7.0，所以商品化的植酸酶又必须在37 ℃左右和pH为2.5～7.0时具有良好的活性，因此很多植酸酶只能满足一方面的需求^[2-3]。

国内对植酸酶的研究已有30多年的历史^[4]，但由于天然来源的植酸酶提取困难、分泌量太低、成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径^[5]。通过基因工程、蛋白质工程等方法不但可提高植酸酶的产量，降低生产和应用成本，而且还可优化植酸酶某些理化性质，使其具有广谱pH耐受性、良好的热稳定性、蛋白酶耐受性等^[6]。

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