论文总字数：16079字

摘 要

威兰胶是由产碱杆菌（Alcaligenes sp. NX-3）分泌的可溶性胞外多糖。由于多方面的优良性能和水溶液的独特流变学特性，使其在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，可以替代很多价格不菲的化学合成品，具有良好的环境友好性和商业开发潜力。

提高微生物细胞的耐热性对于提高生物反应效率、降低控制过程能耗和生产成本至关重要。本文以产碱杆菌Alcaligenes sp. NX-3为载体，通过对其耐热机理进行挖掘与分析探究其耐热功能元素，并利用分子生物学手段对原始菌株NX-3进行了初步改造，使其也可较高的温度下仍然具有威兰胶合成能力。

本论文从高温菌株的耐热元件着手，分析与挖掘出耐热因素DnaJ基因，分别以低温菌株与高温菌株DnaJ基因作为实现菌株改造的基因，借助广宿主载体pBBR1MCS-5和增强型启动子T7成功构建重组质粒并转化到E. coli JM109后，在帮助质粒pRK2013的介导作用下，构建了2株耐热元件加强型的重组菌Alcaligenes sp. DN和Alcaligenes sp. DH。研究发现，Alcaligenes sp. DH重组菌在以葡萄糖为碳源的平板培养基上40 ℃下，仍然能保持高达80%的存活率，在同样温度培养的液体培养基中菌体生长和产物合成仍然能维持较高的水平，这是野生型Alcaligenes sp. NX-3无法达到的水平，研究结果表明高温菌株DnaJ基因能够很好的在野生型中表达并增强其温度耐受能力。

关键词：威兰胶 耐热 改造 温度

Abstract

Welan gum by Alcaligenes sp. (Alcaligenes sp. NX-3) secretion of soluble extracellular polysaccharide. The characteristics of various excellent properties and water solution of the unique rheology, which has extensive application value in many fields of industrial production and life, can replace chemical synthesis products more expensive, environmentally friendly and good potential for commercial development.

To improve the heat resistance of microbial cells to improve efficiency, reduce the biological reaction control process energy consumption and the production cost is very important. In this paper, Alcaligenes Alcaligenes sp. NX-3 as carrier, mining exploration and analysis of functional elements of its heat through the mechanism of its heat, and use molecular biology to the original strain NX-3 conducted a preliminary transformation, it under higher temperatures may also still have welan gum synthesis.

This paper from the heat element for high temperature strain to proceed, analysis and dig out the heat factor DnaJ gene in low temperature and high temperature strain, strain DnaJ gene respectively as the strain improvement by gene, broad host range vectors pBBR1MCS-5 and enhanced T7 promoter to construct recombinant plasmid and transformed into E. coli JM109, in the help of plasmid pRK2013 mediated the guide function, constructed 2 strains resistant components enhanced the recombinant Alcaligenes sp. DN and Alcaligenes sp. DH. The study found, Alcaligenes sp. DH recombinant bacteria culture plate as the carbon source in glucose medium at 40 ℃, still can maintain the survival rate of up to 80%, in the still of cell growth and product formation medium could maintain higher level the same temperature in culture liquid culture, this is the wild type Alcaligenes sp. NX-3 could not be reached research results show that the high temperature strain level, DnaJ gene can be very good in the wild type expression and enhance its temperature tolerance.

Keywords: Welan gum thermostability modification temperature

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1威兰胶的理化性质及应用 2

1.1.1威兰胶理化性质 2

1.1.2威兰胶应用 2

1.2工业威兰胶合成研究现状 3

第二章 材料与方法 4

2.1菌株质粒与培养条件 4

2.2实验仪器与试剂 4

2.3目的基因片段克隆与重组质粒构建 6

2.4三亲本结合获得代谢改造的工程菌 6

2.5代谢工程菌表型特性的考察研究 7

2.6代谢工程菌生长特性的考察研究 7

2.7分析方法 7

2.7.1 生物量的测定 7

2.7.2发酵液中葡萄糖的测定方法 7

2.7.3威兰胶含量的测定： 8

第三章 结果与讨论 9

3.1热休克蛋白基因增强型重组质粒的构建与转化 9

3.1.1 Alcaligenes sp. NX-3和HT-1各目标片段的克隆 9

3.1.2重组质粒的构建与转接验证 10

3.2代谢重组菌表型特性的研究 10

3.3代谢重组菌生长特性的研究 11

第四章 结论与展望 13

4.1 结论 13

4.2 展望 13

参考文献 14

致 谢 16

第一章 文献综述

在化学合成的高分子材料广泛渗入人们生活的同时，其过分依赖石油资源的特性和不易降解而造成的环境问题正日益引起人们的忧虑。在这种形势下，开发环境友好型高分子材料已成为当今世界各国竞相研究的热点之一。其中，微生物多糖就是环境友好型高分子材料的一个重要组成部分^[1]。微生物多糖能在科学研究和工业化生产上取得成功主要基于以下几点：(1)多糖的性质及其具有的应用价值；(2)可以通过选择合适的菌种在受控条件下进行生产；(3)提取工艺的可行性；(4)不含毒素；(5)不同微生物能够合成很多非常特殊的离子型和中性多糖，这些微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，可以替代很多价格不菲的化学合成品，具有良好的环境友好性和商业开发潜力^[2]。目前人们开发出新的具有科学意义和商业价值的微生物多糖主要包括：黄原胶(Xanthan gum)、结冷胶(Gellan gum)、威兰胶(Welan gum)、壳聚糖(Chitasan)、海藻糖(Treha1ose)、透明质酸（Hyaluron）、凝胶多糖(Curdlan)、右旋糖酐(Dextran) 、小核菌葡聚糖（Scleroglucan)、短梗霉多糖（Pullulan）等。其中，微生物合成威兰胶，由于其多方面的优良性能和水溶液的独特流变学特性，引起了工业界的浓厚兴趣。近十几年来，国内外研究者在威兰胶应用方面开展了很多的研究，取得了一定的成果，但对菌种选育、代谢途径及过程控制领域报道很少。

在对威兰胶的前期的研究工作中，研究者将重点放在了结构表征，流变学特性研究以及应用领域的开发，对其菌种选育、发酵过程控制、生物合成机制以及相关基因、酶等方面的研究较少。由于合成途径和机理研究的欠缺，威兰胶的生物合成效率较低，生产成本较高等问题制约了其大规模生产及应用。因此，对威兰胶菌种选育，生物代谢途径和过程控制的研究具有重要的理论与实践意义。

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