论文总字数：27737字

摘 要

糖苷酶亦称糖苷水解酶（glycoside hydrolase），是作用各种糖苷或寡糖使糖苷键水解的酶的总称。随着采用广泛的生物材料进行酶的提纯和性质研究，已知在生物体中存在着许多种类的糖苷酶，利用这些酶的特异的水解作用，已作为研究糖苷、寡糖、多糖的必不可少的试剂。β-呋喃果糖苷酶就是糖苷酶的一种，β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)又称蔗糖酶或转化酶，可以催化水解β-D-果糖苷键,它们广泛分布于生物界中。本文以工程菌含有pET-22b-Fru6的E.coli BL21(DE3)为研究对象，通过优化诱导条件显著提高了β-呋喃果糖苷酶的表达量，研究了多种纯化手段，获得了电泳纯的β-呋喃果糖苷酶，再利用纯化后的酶进行结晶条件的筛选。本论文的主要研究工作如下：

1. 对含有pET-22b-Fru6的E.coli BL21(DE3)发酵产β-呋喃果糖苷酶Fru6的诱导条件进行了优化。最佳的诱导条件为：IPTG浓度为0.4mmol/L，诱导温度为25℃，诱导时间为8h。优化过后，β-呋喃果糖苷酶Fru6实现了高效表达。

2. 采用三种方法对β-呋喃果糖苷酶Fru6进行纯化，一种是Source 15Q 强阴离子树脂交换层析，纯化流程为：发酵液上清 50%硫酸铵沉淀后上清液 90%硫酸铵沉淀

15Q强离子交换 获得目的蛋白。通过优化，得到最适合的盐析的条件。另外一种是镍柱亲和层析。还有一种是疏水层析，最后通过蛋白电泳和测酶活的方法对三种方法进行比较，发现镍柱亲和层析的纯化效果最好。

3. 采用座滴式气相扩散法培养fru-6蛋白晶体，通过初筛和复筛，对结晶的条件进行了优化。最后，获得了符合衍射要求的蛋白质单晶。

关键词：β-呋喃果糖苷酶 表达 纯化 结晶

Efficient Heterologous Expression, Purification and Preliminary of Crystallization conditions of β-fructofuranosidase

Abstract

Glucosidase is also known as glycoside hydrolase(glycoside hydrolase).And glucosidase is the floorboard of the enzyme that plays a role of hydrolyzing the glycosidic bond of all sorts of glycosidic or sugars. With the widespread use of biological material to make a study of the properties and nature of the enzyme.We known that there are many kinds of glycosidases in the organism. Using these enzyme^,s specific hydrolysis, we can make a research of glycosides, oligosaccharides, polysaccharides.β-fructofuranosidase is a kind of glycosidase.And β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) is also known as sucrase or invertase what can catalyze the hydrolysis of β-D-glycosidic bond. And they are also widely distributed in organisms . In this paper ,we use the engineering bacteria E.coli BL21(DE3) what containing pET-22b-Fru6 as the research object.We improved the yield of the β-fructofuranosidase significantly by optimizing the induction conditions .Then we purified the β-fructofuranosidase .Finally we use the purified enzyme to crystal.The main work of this paper is as follows:

1. The best composition of culture medium for: peptone 10 g /L ; Yeast powder 5 g /L; NaCl 10 g /L ; PH nature. We optimize the induction condition to produce the β-fructofuranosidase fru6 using the engineering bacteria E.coli BL21(DE3) what containing pET-22b-Fru6.The best induction conditions is that: the concentration of IPTG is 0.4mmol/L, the temperature of the induction is 25℃,the time of induction is that 8h.Under the optimized conditions, β-fructofuranosidase fru6 expressed highly.
2. We use three methods to purify the β-fructofuranosidase fru6.The first one is the Source 15 q strong anion exchange resin chromatography.The purification process is that: the fermented supernatantr ,clear liquid on 50% ammonium sulfate precipitation, 90% ammonium sulfate precipitation ,15 Q strong ion exchange , for purpose of protein. Through optimization,We get the most suitable condition of salting out. Another method is nickel column affinity chromatography. Lastly is thin layer chromatography. Finally we compared these three methods by protein electrophoresis and enzyme activity.Then we can find that the nickel column affinity chromatography is the best method.to purify.

3.We use drop type gas phase diffusion method to train fru-6 protein crystals.And optimizate the conditions of the crystallization .Finally,we get the protein single crystals what is accord with diffraction require by primary and secondary screening.

KeyWords:β-fructofuranosidase; Expression;Purification; Crystallization

目 录

摘 要 Ⅰ

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 β-呋喃果糖苷酶的特点 1

1.2.1 作用的最佳温度很容易达到 2

1.2.2 具有良好的耐热性 2

1.2.3 具有良好的pH稳定性 2

1.2.4 不同的金属离子和化学物质对酶活有不同的影响 2

1.3 β-呋喃果糖苷酶的作用机理 2

1.4 β-呋喃果糖苷酶的生产 3

1.4.1 β-呋喃果糖苷酶的异源表达 3

1.4.2 β - 呋喃果糖苷酶的纯化 4

1.4.3 β-呋喃果糖苷酶的结晶 5

1.5 AKTA蛋白纯化仪简介 6

1.5.1 主要技术指标 6

1.5.2 功能/应用范围 6

1.5.3 基本原理 6

1.5.4 常用层析方法 7

1.6 课题研究的目的和意义 7

1.6.1 产低聚乳果糖 7

1.6.2 产低聚果糖FOS 7

1.6.3 鉴定蜂蜜是否新鲜 8

1.6.4 β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的改性研究 8

1.6.5 β-呋喃果糖苷酶作用于大豆低聚糖，增加大豆低聚糖中功能因子的含量 8

第二章 β-呋喃果糖苷酶Fru-6表达与纯化 10

2.1 前言 10

2.2 材料与方法 10

2.2.1 菌株 10

2.2.2 实验试剂与仪器 10

2.2.3 培养基组成 11

2.2.4 β-呋喃果糖苷酶Fru-6表达条件优化 11

2.2.5 β-呋喃果糖苷酶的纯化 12

2.3结果与讨论 15

2.3.1最佳诱导IPTG浓度 15

2.3.2最佳诱导温度 16

2.3.3 最佳诱导时间 17

2.3.4 盐析条件的确定 18

2.3.5 Source 15Q 强阴离子树脂交换层析 20

2.3.6 镍柱亲和层析 20

2.3.7 疏水层析 22

2.4 本章小结 22

第三章 β-呋喃果糖苷酶Fru-6成熟肽的结晶 23

3.1 前言 23

3.2 材料与方法 23

3.2.1 实验试剂与仪器 23

3.2.2 β - 呋喃果糖苷酶的结晶条件筛选 24

3.2.3 晶体的酶活检测 24

3.2.4 β - 呋喃果糖苷酶的结晶条件复筛 24

3.2.5 β - 呋喃果糖苷酶的晶体的X射线衍射鉴定 24

3.3 结果与讨论 25

3.3.1 β - 呋喃果糖苷酶的结晶条件筛选 25

3.3.2 β - 呋喃果糖苷酶的结晶条件复筛 25

3.3.3 β - 呋喃果糖苷酶的晶体的X射线衍射鉴定 26

3.3.4 Fru-6衍射数据的收集和处理 26

3.4 本章小结 26

第四章 结论与展望 28

4.1 结论 28

4.2 工作展望 28

参考文献 29

致谢 31

第一章 文献综述

1.1 引言

糖基化合物又称糖苷类化合物或配糖体，在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值。近来，糖科学和糖组学在国际学术界和新兴产业界均得到了高度关注，传统的糖苷化合物化学合成存在着步骤复杂，反应剧烈，合成产率低，立体选择性差，副产物多等缺点，特别是有些反应目前利用化学手段较难实现，而用酶进行生物转化却可弥补化学合成的不足。糖苷酶(glycosidases)和糖基转移酶(glycosyltransferases)是具有转糖基作用的两类酶，在合成糖苷化合物中起着重要的作用^[1]。

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