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摘 要

蛋白酶是一种重要的高效工业生物催化剂，而由于非水相中生物催化的诸多优势，促进了耐有机溶剂蛋白酶类的研究和发展。但野生数耐有机溶剂微生物产酶量较低，限制了这类高性能的耐有机溶剂蛋白酶的使用，需要借助基因工程的手段进行改造，以达到生产的需要。

本实验使用在本实验室分离筛选的耐有机溶剂蛋白酶产生菌Bacillus cereus WQ9-2的基础上，在大肠杆菌中构建了用以表达的重组质粒pMA5/aprWQ，重组质粒不含目的基因的信号肽序列（穿梭载体pMA5自身携带信号肽），将重组质粒并转化至枯草芽孢杆菌宿主中构建重组菌WB600-pMA5/aprWQ进行发酵表达，重组菌的最高产酶量可达3770U/mL，重组菌分泌的蛋白酶经SDS-PAGE检测表明其分子量约为37kDa，与Bacillus cereus WQ9-2所产蛋白酶亚基分子量一致。

关键词：耐有机溶剂 蛋白酶 WB600-pMA5/aprWQ 有机相体系

High efficient expression of organic solvent protease in Bacillus subtilis WB600

ABSTRACT

Protease are considered as the effective biocatalysts, the development of solvent-tolerant enzymes has promoted owing to numerous advantages for biocatalysis in organic solvent. However, the low enzyme production of most organic solvent-tolerant bacteria limits the use of this kind of enzyme, so the method of genetic engineering has used for expanding the application of organic solvent-tolerant enzyme.

In the previous work, a solvent-tolerant strain Bacillus cereus WQ9-2 which produces solvent-tolerant protease has isolated, on the basis of it the expression plasmid pMA5/aprWQ was constructed by inserting the aprWQ gene into the vector pMA5 without native signal peptide sequence, the recombinant plasmid pMA5 harboring aprWQ gene was transformed into the Bacillus subtilis WB600 competent cells, the activity of recombinant protease was 3770U/mL. SDS-PAGE analysis of recombinant strain supernatant indicated the molecular mass of recombinant protease was approximately 37kDa, which was in accordance with the purified solvent-tolerant protease WQ.

Keywords：Organic solvent-tolerant protease；Over-expression; Bacillus subtili

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2耐有机溶剂微生物的发现 1

1.3耐有机溶剂蛋白酶类介绍 2

1.4 枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展 3

1.5外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达的研究 4

1.6研究的目的、意义及内容 5

1.6.1 课题目的及意义 5

1.6.2 研究内容 5

第二章 耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2基因的克隆表达 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌种和质粒 6

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 实验仪器 8

2.1.4 培养基 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 蛋白酶基因表达引物设计 9

2.2.2 基因组的提取 10

2.2.3 表达载体pMA5/aprWQ的构建 11

2.2.4 重组菌WB600-pMA5/aprWQ的构建 14

2.2.5 重组菌WB600-pMA5/aprWQ的发酵表达 15

2.2.6 蛋白酶酶活的测定 15

2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳 15

2.3 结果与讨论 17

2.3.1 蛋白酶WQ基因的扩增 17

2.3.2 表达载体pMA5/aprWQ的构建 18

2.3.3 重组菌WB600-pMA5/aprWQ构建及表达 20

2.3.4 SDS-PAGE分析 21

第三章 结论与展望 22

3.1 结论 22

3.2展望 22

参考文献 23

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1前言

高性能微生物和酶类的开发很大程度上决定了工业生物技术的发展,将生物催化剂(一般为生物细胞和酶) 运用于有机相中催化化学反应具有许多优点,这是生物催化领域的一个新的突破口,因此有机相生物催化已经成为生物催化领域中的一个研究热点^{[1 ,2]}。

通常有机溶剂对大多数生物催化剂具有极大的毒害作用,因此，推动有机相生物催化发展的关键是如何获得高效稳定的新型生物催化剂。高效生物催化剂的重要来源是极端微生物，其应用价值的主要代表有嗜热菌、嗜盐菌及耐辐射微生物等^[3]。

耐有机溶剂微生物是一类新颖的极端微生物,它们能够在高浓度的有机溶剂中生长代谢，而由于从这类微生物中分离到的一些酶类往往也具有耐有机溶剂的性能，因此，化学家的注意力渐渐被它们所吸引^{[1,2 ,4-6 ]} 。随着工业生物催化技术的发展和推广应用,耐有机溶剂微生物及酶类逐渐显示其巨大的应用潜力。

1.2耐有机溶剂微生物的发现

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