论文总字数：17424字

摘 要

尿嘧啶核苷酸,也称一磷尿苷，简称UMP。是一种存在于RNA中的核苷酸,也是一种由磷酸与核苷尿苷所组成的酯类。包含磷酸官能基、五碳糖（核糖），以及碱基尿嘧啶。其分子式是C₉H₁₃N₂O₉P，分子量为324。已知有2′-，3′-，5′-三种异构体。尿嘧啶核苷酸可作为食品添加剂，也可作为药物前体，其作为重要的前体物质，在寡聚糖合成和抗癌药物生产中，有着无可替代的作用。同时，现阶段嘧啶核苷酸的生产困难，价格昂贵，使其在我国具有很大的市场需求，商业价值。

实验通过本实验室的前期研究，了解UMP在谷氨酸棒杆菌中会被5'-核苷酸酶分解，为了提高UMP的积累量故需要将UMP的分解支路进行阻断。为了阻断UMP的分解支路，实验构建了敲除5’-核苷酸酶基因的同源重组质粒PK18mobSacB-One。经过两次同源重组后，将完成基因敲除后的菌株，命名为：谷氨酸棒杆菌1017(记作C.glx-1017) 。转入表达质粒pL-F-dapA-E，获得的重组菌进行了发酵实验。UMP分解支路阻断后的C.glx-1017的UMP产量为360mg/L，较出发菌株提高了3.6倍。而UMP分解支路阻断和关键基因过表达组合效应重组菌,其UMP产量为9.93g/L，较出发菌株提高了3.9倍,实现了实验目标。

关键词：尿嘧啶核苷酸 谷氨酸棒杆菌 5'-核苷酸酶 基因敲除 全细胞催化

ABSTRACT

Uracil nucleotides, also known as a uridine phosphate, referred UMP.It is a nucleotide presented in the RNA ,It is also an ester consisted of phosphoric acid with the nucleoside uridine.It contains acid-functional groups, five-carbon sugar (ribose), and uracil bases.Its molecular formula is C₉H₁₃N₂O₉P,Molecular weight of 324.It has three isomers, namely, 2'-, 3'-, 5'-.Uracil nucleotides can be used as food additives and also be used as a prodrug.As an important precursor ,in the synthesis of oligosaccharide production and production of anticancer drugs, it has an irreplaceable role.Meanwhile, at this stage ,it is difficult and expensive to produce the pyrimidine nucleotides,so that it has a great market demand and commercial value in China.

Through previous studies in our laboratory,We learned UMP in the Corynebacterium glutamicum may be decomposed 5'-nucleotidase,in order to increase the accumulation of UMP ,so need to block the decomposed branch . In order to block the UMP decomposition branch，we constructed the homologous recombinant plasmid PK18mobSacB-One to knockout 5'-nucleotidase gene .After two homologous recombination,the strains after the completion of knockout,we named: glutamicum 1017 (referred to as C.glx-1017).we transferred the expression plasmid pL-F-dapA-E, recombinant bacteria fermentation experiments were obtained.The C.glx-1017 after blocked the decomposition branch,UMP yield was 360mg / L, improved 3.6 times to compare with the original strain .However,the recombinant bacteria which UMP decomposition branch was block and key genes were over expression,Its UMP production was 9.93g / L,improved 3.9 times to compare with the original strain. We achieved the goal of the experiment.

Key words：Uracil nucleotide Corynebacterium glutamicum 5'-nucleotidase knockout Whole-cell catalysis

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2基因敲除技术 1

1.2.1同源重组 1

1.2.1.1同源重组体的筛选及鉴定 1

1.2.2基因敲除 2

1.2.2.1基因敲除的技术路线 2

1.2.2.2基因敲除技术的缺陷 2

1.2.2.3基因敲除技术的应用及前景  2

1.3尿嘧啶核苷酸的制备 3

1.3.1尿嘧啶核苷酸的生成 3

1.3.2尿嘧啶核苷酸的制备方法 4

1.3.2.1微生物发酵法 4

1.3.2.2全细胞催化法 5

1.3.2.3全细胞催化法的优点 6

1.4 课题研究思路 7

第二章 实验材料及分析方法 8

2.1实验仪器和试剂 8

2.2分析方法的建立 10

2.2.1UMP代谢分解支路的阻断 10

2.2.1.1引物设计 10

2.2.1.2 PCR体系及反应条件 10

2.2.1.3质粒的提取 11

2.2.1.4同源敲除质粒的构建 11

2.2.1.5重组菌的筛选 12

2.2.2发酵过程中的代谢调控和生产方法的改进 12

2.2.2.1菌株与培养条件 12

2.2.2.2培养基及培养方法 13

2.2.3代谢调控策谷氨酸棒杆菌发酵 13

2.2.3.1发酵方法 13

2.2.4全细胞催化法生产UMP 14

2.2.4.1培养基 14

2.2.4.2.菌体培养 14

2.2.2.3 HPLC法检测产物 14

第三章 结果与讨论 16

3.1同源敲除质粒的构建 16

3.2重组菌的筛选 17

3.3验证重组菌的发酵产量 18

3.4全细胞催化法生产UMP 18

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1引言

尿嘧啶核苷酸,也称一磷尿苷，简称UMP。是一种存在于RNA中的核苷酸,也是一种由磷酸与核苷尿苷所组成的酯类。包含磷酸官能基、五碳糖（核糖），以及碱基尿嘧啶。其分子式是C₉H₁₃N₂O₉P，分子量为324。已知有2′-，3′-，5′-三种异构体。由乳清酸核苷-5′-磷酸经酶催化脱羧而成。是生物体内UTP、CTP合成的共同的前体，通过酶催化磷酸化生成UDP、UTP。由乳清酸核苷-5′-磷酸经酶催化脱羧而成。尿嘧啶核苷酸可作为食品添加剂，也可作为药物前体，其作为重要的前体物质，在寡聚糖合成和抗癌药物生产中，有着无可替代的作用^[1]。同时，现阶段嘧啶核苷酸的生产困难，价格昂贵，使其在我国具有很大的市场需求，商业价值。

1.2基因敲除技术

1.2.1同源重组

基因的同源重组（homologous recombination）是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。是外源细胞染色体中DNA与受体细胞内染色体DNA上的同源基因序列之间发生重组,并在预定位点上整合,由此使细胞遗传特性得到改变的方法^[2,3]。同源重组可以发生在所有的菌株内，是一种最基本，也是最重要的重组方式，并且，同源基因序列越长越容易发生基因重组。在基因工程中，目的基因添加于抗性基因两侧，同时，以两侧的基因片段作为同源臂，通过发生同源重组，重组交换两侧的同源臂，使抗性基因替代目的基因。根据重组后靶基因的特征可以把同源重组分为两种类型:

（1）靶基因被破坏或剔除，即靶基因原有结构被破坏。

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