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摘 要

肿瘤细胞依赖于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）提供生存和发展因子。基因毒疗法促使肿瘤基质发生损伤性改变，其中包括多种胞外分泌蛋白的表达。驱动基因毒作用下基质细胞表型发生深刻改变的生化程序被称为DNA损伤分泌程序（DNA damage secretory program, DDSP）。尽管DDSP对肿瘤细胞存活、再增殖和获得性耐药等恶性特征有深刻影响，但调控其表达的机制仍然知之甚少。在本研究中，我们经过检测基质细胞中显著增加的γ-H2AX(磷酸化H2AX)焦点数量，确定化疗药物顺铂处理可明显诱导前列腺成纤维细胞发生DNA损伤，并通过实时荧光定量PCR证实DNA损伤的产生导致DDSP因子表达急剧增加。此外，我们发现药物抑制有丝分裂原活化蛋白激酶p38（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK）或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）不仅显著下调一些DDSP因子的转录水平，而且适度抑制DNA损伤背景下前列腺成纤维细胞产生的条件培养基的促瘤活性。论文实验结果表明p38MAPK和mTOR在DDSP表达调控中的重要生物学作用，今后的深入研究有望根据其作为基因毒治疗条件下控制TME病理活性的新型药物靶点而开展的一些列预临床和临床阶段研究。

关键词：肿瘤微环境 DNA损伤分泌程序 细胞衰老 有丝分裂原活化蛋白激酶p38 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 药物靶向 癌细胞增殖 恶性特征

Drug targeting study and mechanism of DNA damage

secretory phenotype in prostate stromal cells

Abstract

Neoplastic cells rely on the tumor microenvironment (TME) for survival and progression.Genotoxicity-induced alterations in the tumor stroma include the expression of a diverse spectrum of extracellular proteins collectively referred to as the DNA damage secretory program (DDSP).Despite the profound impact the pro-tumorigenic DDSP exerts on tumor cell survival,proliferation and acquired resistance to anticancer treatments, the mechanisms that control the expression of DDSP factors remain poorly understood.Here,We determined that cisplatin treatment dramatically induces DNA damage with the evidence of substantially increased number of γ-H2AX foci in prostate fibroblasts and confirmed that DNA damage generates DDSP phenotype by quantitative RT-PCR.We next found that inhibition of p38MAPK (mitogen-activated protein kinases) or mTOR(mammalian target of rapamycin) not only markedly reduces transcription of multiple DDSP components ,but also moderately suppresses the tumor-promoting activities of conditioned medium from DNA-damaged prostate fibroblasts.This study pinpoints critical roles of p38MAPK and mTOR in DDSP development and demonstrates that both of these cytoplasmic proteins may be exploited as new therapeutic targets.

Keywords: tumor microenvironment; DNA damage secretory program; cell senescence; p38MAPK; mTOR; drug targeting; cancer cell proliferation; malignant phenotype

目录

摘要 2

Abstract 3

第一章 文献综述 6

1.1 前言 6

1.2 DNA损伤应答 6

1.2.1 放、化疗损伤细胞DNA的机制 6

1.2.2 细胞内DNA损伤应答的分子机制 7

1.2.3 DNA损伤后细胞命运的抉择 7

1.3 DNA损伤分泌程序 8

1.3.1 衰老相关分泌表型（SASP） 8

1.3.2 DDSP与SASP的区别 9

1.3.3 DDSP的特点及功能 9

1.3.4 DDSP与抗癌疗法 10

1.4 结论与展望 11

第二章 前列腺基质细胞DDSP的药物靶向控制和分子机理探讨 12

2.1 材料与方法 12

2.1.1 细胞系及其培养方法 12

2.1.2 主要仪器设备 12

2.1.3 主要缓冲液的配制方法 12

2.1.4 主要试剂耗材 13

2.1.5 qRT-PCR引物序列 14

2.2 实验方法 15

2.2.1 细胞的药物处理 15

2.2.2 免疫荧光染色 15

2.2.3 细胞总RNA的提取 16

2.2.4 第一链cDNA的合成 16

2.2.5 实时荧光定量PCR 17

2.2.6 条件培养基的收集 18

2.2.7 细胞增殖实验 18

2.3 实验结果 18

2.3.1 顺铂及激酶抑制剂处理致使细胞形态改变 18

2.3.2 化疗药物诱导正常基质细胞发生DNA损伤 18

2.3.3 细胞DDSP基因转录水平发生变化 20

2.3.4 p38MAPK和mTOR的抑制削弱DDSP促癌细胞增殖作用 21

2.4讨论 21

第三章 结论与展望 23

3.1 结论 23

3.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1 前言

传统意义上的恶性肿瘤治疗主要有三大方法，包括外科手术、放射治疗和化学治疗（简称化疗）。尽管使用阻滞肿瘤细胞增殖的常规细胞毒类抗癌药常引起骨髓抑制等不良反应，化疗在肿瘤的综合治疗中仍占有极为重要的地位^[1]。然而，在一些常见的实体瘤如乳腺癌、结肠癌、胃癌及前列腺癌中，组成肿瘤基质的正常细胞可以占据整个肿瘤组织的90%以上。在放、化疗过程中，这些数目可观的良性细胞也不可避免地遭受电离辐射和基因毒药物造成的DNA损伤。DNA损伤发生后，细胞会迅速启动其DNA损伤修复调控系统，暂时抑制细胞生长，直至DNA损伤得以修复，细胞周期方能继续运转；若DNA损伤严重以致难以修复，则通过衰老或凋亡相关机制，使得肿瘤进入不可逆转的生长抑制状态^[2]。

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