论文总字数：20109字

摘 要

甜叶菊整株包括根、茎、叶含有大量的天然甜味剂甜菊糖苷。甜菊糖苷中含有莱苞迪甙A，B，C，D等。其中，莱苞迪甙A的含量最高，莱苞迪甙D含量较少。因此，本实验通过番茄来源糖基转移酶和蔗糖合酶将莱苞迪甙A转化为莱苞迪甙D，莱苞迪甙D是本次实验的主要目标产物。

本实验合成了一条番茄来源糖基转移酶Tm1的基因序列，并将它与一条蔗糖合酶基因序列分别共建在大肠杆菌pETDuet质粒和毕赤酵母pPIC9K质粒。经过转化，筛选，获得一株重组大肠杆菌与重组毕赤酵母，分别进行诱导表达，获得可溶性表达蛋白。通过Brandford法测得大肠杆菌和毕赤酵母可溶性蛋白含量分别为0.286mg/mL和0.112mg/mL。

关键词： 甜菊糖苷 莱苞迪甙D 糖基转移酶 蔗糖合酶 蛋白表达量

Recombination Expression of Glycosyltransferase from Tomato

ABSTRACT

Stevia including roots,stems and leaves contain a large amount of natural sweetener stevia. Stevioside contains rebaudioside A,B,C,D and so on.Especially the amount of rebaudioside A is the highest and rebaudioside D content less. The rebaudioside A comparing with rebaudioside D,rebaudioside D have no bitterness.Therefore,through tomato source glycosyltransferase and sucrose synthase to transfer rebaudioside A into rebaudioside D.And rebaudioside D is the main target product in this experiment.

In this study,a gene sequence of tomato source glycosyltransferase Tm1 and compares it with a sucrose synthase gene sequences were build in E.coli and Picha plasmid pETDuet and pPIC9K plasmids. After transformation, filtering to obtain a recombination E.coli and Picha pastoris, were induced to obtain a soluble protein. Through Brandford method as measured soluble protein contents.And the soluble protein in E.coli is 0.286mg/mL.,then 0.112mg/mL in Picha.

Key Words: Stevioside; Rebaudioside D; Glycosyltransferase; Protein expression; Sucrose Synthase

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 甜叶菊简介 1

1.2 甜菊糖苷的结构与性质 1

1.3 反应机理 3

1.4 甜菊糖分离纯化方法 3

1.4.1 高效液相色谱（HPLC） 3

1.4.2 薄层层析（TLC） 3

1.5 甜菊糖的应用前景 4

1.6 pETDuet载体表达系统与pPIC9K载体表达系统 4

1.6.1 pETDuet载体表达系统 5

1.6.2 pPIC9K载体表达系统 5

第二章 实验方法与材料 8

2.1 实验材料与实验仪器 8

2.1.1 实验仪器 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 菌株、质粒、工具酶、分子量标准和试剂盒 9

2.1.4 实验试剂配方 10

2.2 实验方法 12

2.3 重组质粒的转化与表达 15

2.4 蛋白浓度的验证 18

第三章 结果与讨论 20

3.1 Tm1基因的克隆 20

3.1.1 pETDuet-Tm1-SUS质粒的获取 20

3.2 蛋白凝胶图谱 21

3.2.1 Tm1在毕赤酵母表达蛋白凝胶的结果图 21

3.2.2 大肠杆菌BL21(DE3)中表达Tm1的蛋白凝胶结果图 22

3.3 Tm1酶学性质的研究 23

3.3.1 Brandford法测定毕赤酵母GS115培养液中蛋白浓度曲线变化图 23

3.3.2 Brandford法测定大肠杆菌培养液中蛋白浓度曲线变化图 23

第四章 结果与展望 25

4.1 结论 25

4.2 展望 25

参考文献 26

致 谢 29

第一章 文献综述

1.1 甜叶菊简介

甜叶菊整株包括根、茎、叶含有大量的天然甜味成分甜菊糖苷^[1]。甜叶菊叶片含甜菊糖苷7~13%，并且甜菊糖苷具有热量低、甜度高的性质^[2]，是蔗糖的合适替代品，也是食品及药品工业的原料之一。近期，食品添加剂的安全性也是媒体监督的焦点，然而经过医学临床实验说明，甜菊糖苷不具有致癌性、致畸形和毒性，所以，甜菊糖苷还是一种可安全食用的天然食品甜味剂。与此同时，它具有一定的保健作用，例如调节血压、软化血管、降低血脂、降血糖、尿糖、抑菌止血、镇痛等功能^[3]。

甜菊糖苷由于基础结构类似，经过定向修饰可以将莱苞迪甙A转化为莱苞迪甙D。因此，通过生物转化的得到甜菊糖苷衍生物是近几年研究的主要方向。值得一提的是，甜菊糖苷中的80%的成分为莱苞迪甙A，甜叶菊提取物种的主要甜味来源于是莱苞迪甙A，其中莱苞迪甙A的甜度是蔗糖的300倍^[4]。甜菊糖苷中不仅仅只有莱苞迪甙A，还有B，C，D，E等莱苞迪甙。它们的甜度具有较大差距，含量也相比于莱苞迪甙A微量。其中，莱苞迪甙D没有苦涩味，所以是本次实验的目标产物。

1.2 甜菊糖苷的结构与性质

甜菊糖苷是甜叶菊提取物中的主要物质。甜菊糖苷可分为RA甙，RB甙，RD甙，RE甙和甜菊双糖苷，甜茶苷，杜克苷等。他们具有同样的糖苷元——甜菊醇（Steviol）(图1)，仅C19和C13位上连接不同数量的葡萄糖基、木糖基或鼠李糖基，从而形成理想化性能、味质各异的甜菊糖苷（表1）^[5]。

图1 甜菊糖苷的结构

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