论文总字数：14211字

摘 要

萤火虫萤光素酶（luciferase）在ATP、Mg² 、O₂等存在时，能够高效催化荧光素的发光反应。本论文一方面基于实验室现有的荧光素酶表达菌株 lucWT-pQE30（野生型）和lucCir-pET22b（环化型），通过载体替换，构建新型菌株lucWT-pETM3C和lucCir-pETM3C。在30℃条件下，使用0.1mM IPTG诱导表达后测定蛋白浓度。在50 ml培养基体系下，lucWT-pQE30 最终得到蛋白0.87 mg； lucWT-pETM3C得到蛋白1.7 mg。该载体替换使野生型荧光素酶菌株的表达量提升了95%；对于环化菌株而言，载体替换对蛋白表达量没有影响。另一方面我们对lucCir-pET22b菌株在16℃（诱导16 h）和30℃（诱导10 h）进行了对比实验，最终在16℃（诱导16 h）条件下该菌株表达量较30℃（诱导10 h）条件下蛋白表达量提高了44%，达到了3.6 mg。

关键词 荧光素酶 大肠杆菌 蛋白表达 蛋白纯化

The optimization of luciferase expression

Abstract

Luciferase can efficiently catalyze the luminescence reaction of fluorescein under the condition of ATP, Mg² and O₂. On the one hand, we constructed recombinant vector stains lucWT-pETM3C and lucCir-pETM3C from the original strain lucWT-pQE30 (wide type) and lucCir-pET22b (mutant). Induction of expression at the 30℃ with 0.1 mM IPTG yields luciferase protein. In 50ml medium system, the lucWT-pETM3C eventually gets protein 1.7 mg compared with the lucWT-pQE30 0.87 mg. It indicated that the new vector can increased the protein expression in the wide type stains by 95%. As for the cyclized mutant strains, these final protein expression is almost the same. On the other hand, we induced the lucCir-pET22b strain at 16℃ (16 h) and 30℃ (10 h). The results indicated that the protein expression at 16℃ (16 h) is 3.6mg and it is 44% higher than that at 30℃(10h).

KEY WORDS luciferase; Escherichia coli; protein expression; protein purification

目录

摘要 Ⅱ

Abstract Ⅲ

第一章 文献综述 1

前言 1

1.1 荧光素酶的简介 1

1.1.1 荧光素酶的基本特性 1

1.1.2 荧光素酶的发光原理 2

1.1.3 荧光素酶的研究历史 2

1.2 荧光素酶的应用及研究现状 3

1.3表达菌株及蛋白质表达策略 3

1.3.1大肠杆菌相关简介 3

1.3.2蛋白表达策略 4

1.4蛋白质的分离纯化 4

第二章 实验材料及方法 6

2.1 实验材料、实验仪器、实验菌株及载体等 6

2.2实验方法 8

2.2.1重组载体菌lucWT-pETM3C和lucCir-pETM3C的构建 8

2.2.2荧光素酶基因工程菌的诱导表达 10

2.2.3荧光素酶蛋白的纯化 10

第三章 实验结果分析和结论与展望 13

3.1实验结果分析 13

3.1.1 lucWT-pETM3C和lucCir-pETM3C的构建结果分析 13

3.1.2荧光素酶基因在不同载体下蛋白表达结果分析 13

3.1.3荧光素酶基因在不同诱导温度下的蛋白表达结果分析 14

3.2结论与展望 15

参考文献 16

致谢 18

第一章 文献综述

前言

19世纪50年代以来，全球各界对于荧光素酶的研究不断展开，使得其应用范围从实验室渐渐走入社会。荧光素酶因其独特的发光特性，在食品药品、医学研究、环境检测等领域发挥着独特的作用。以间接体外成像技术为例，将不同类型的细胞标记上萤光素酶，因为其发光性质，可以在高CCD相机^[18]下对动物体细胞进行活体观察。该方法特有的优点是在不对活体细胞产生伤害的情况下，实现了对整个动物体中的细胞群落的分析。但是荧光素酶十分敏感，稳定性较差，保存条件较高，这大大限制了其产品的开发和利用效率。因此，如何实现荧光素酶的高效表达和大规模生产成为近年来国内外研究的热点问题。

传统荧光素酶生产方式是从萤火虫尾部提取获得，虽然该方法获得的荧光素酶纯度较高，但也存在着成本高、周期长、产量低等问题。而采用基因工程菌发酵方式来生产荧光素酶在解决以上问题时具有明显优点^[19]。同时荧光素酶具有易纯化、易诱导的特征^[15]，这能够便于检测基因工程菌是否构建成功。

本工作以实验室现有的荧光素酶表达菌株为出发点，旨在通过分子改造和发酵条件优化来提高荧光素酶重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。

1.1 荧光素酶的简介

1.1.1 荧光素酶的基本特性

荧光素酶的种类繁多，主要包含萤火虫荧光素酶（例如北美萤火虫荧光素酶、日本萤火虫荧光素酶等），细菌荧光素酶（现已从发亮发光杆菌、大肠杆菌、费氏弧菌等多种菌株中提取获得）等^[4]。大部分荧光素酶是由单一肽链构成的，以从北美萤火虫提取的荧光素酶为例，结构图如图1.1.1所示，它是由551个氨基酸构成的单一肽链，相对分子质量约62 kDa^[6]。在ATP、Mg² 、O₂等存在时，能高效催化荧光素实现发光反应，其最适反应温度37℃，最适反应pH为7.8^[2,6]。荧光素酶的高级结构中，主要由以下氨基酸残基作用：R218 R337 F247 S347 G315 G339 G341 K529 H245 等，这些残基分别和相应底物结合发生反应，同时产生荧光^[6]。

图 1.1.1 荧光素酶蛋白结构图

1.1.2 荧光素酶的发光原理

细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，在FMNH₂及O₂的参与下，使脂肪醛氧化为脂肪酸并发出光子，荧光波长为490nm^[16]。萤火虫荧光素酶在镁离子、ATP和O₂的参与下，催化右旋荧光素发生氧化脱羧反应，产生激活态的氧化荧光素，在它的作用下将化学能转化为光能，释放波长为550~580nm的荧光^[16]。

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